Application des contraintes ambiguës et solvatation dans une bulle d’eau

à un fragment pTxxD.

Dans le cadre des 30 simulations lancées sur le domaine FHA1 de Rad53 complexé à un peptide contenant une aspartate en position pT+3. Une analyse des différents contacts du réseau de liaisons hydrogènes a été effectuée comme précédemment (table 22). Les résultats sont surprenants. D’un côté, on constate que le nombre de structures présentant un, deux ou trois contacts natifs baisse drastiquement. En revanche, alors que précédemment aucune structure échantillonnée ne présentait les cinq contacts natifs simultanément, l’application des contraintes ambiguës permet d’atteindre cette conformation (0,36% des structures). Une inspection visuelle des structures échantillonnées au cours des 30 dynamiques permet de comprendre ce paradoxe. La figure 69 présente certaines des structures les plus fréquemment générées. On constate que parmi ces structures, un certain nombre présentent des conformations inexactes dues à l’application des contraintes ambiguës (figure 69-1,2,3). Notamment, la présence d’un glutamate en position 137 piège fréquemment les dynamiques dans des conformations qui favorisent des liaisons hydrogènes entre les chaînes latérales de

Nombre d'occurrences des liaisons hydrogènes impliquant

l'arginine 83 et ses partenaires (sur 4500) Contraintes ambiguës dans l'eau (300K)

Total Pourcentage

Aucun contact natif 4455 99,00

Un seul contact natif 0 0,00

Deux contacts natifs simultanés 1 0,02

Trois contacts natifs simultanés 37 0,82

Quatre contacts natifs simultanés 42 0,93

Cinq contacts natifs simultanés (topologie native) 16 0,36

table 22 : Table comptabilisant le nombre d’occurrences où les contacts natifs de l’arginine 83 et ses partenaires sont respectés. Le temps total de dynamique est de 5ns et une structure est analysée toutes les 2ps, ce qui ramène à 2500 le nombre de structures analysées.

figure 69 : Réseaux de liaisons hydrogènes mis en place dans la poche de reconnaissance lorsque les contraintes ambiguës sont appliquées. Les simulations sont effectuées dans le champs de force OPLS de Gromacs, à une température de 300K. Les topologies exposées sont classées en fonction de leur fréquence d’apparition. Parmi les topologies explorées se trouve la topologie native (topologie #4).

Topologie #1 Topologie #2

Topologie #4 = Topologie Native

Puisque la conformation native du réseau de liaison hydrogène est générée au cours de la dynamique sous contraintes ambiguës, deux questions nous ont intéressées et seront l’objet des paragraphes suivants.

(i) Une fonction d’énergie de type FOLDEF est-elle capable de discriminer et d’identifier ces structures aux contacts natifs parmi les différentes structures générées lors des 30 simulations du domaine FHA1 de Rad53 en contact avec le peptide pTxxD ?

(ii) Si tel est le cas, cette stratégie est-elle efficace dans le cadre d’un criblage pour identifier le motif pTxxD comme le plus affin ?

6.4.2 Première question : peut-on discriminer la conformation native du réseau de liaisons hydrogènes à l’aide d’une fonction d’évaluation ?

Au vu des résultats obtenus au chapitre précédent concernant le criblage virtuel de domaines FHA et BRCT sur squelette rigide, nous avons sélectionné la fonction d’énergie FOLDEF pour l’évaluation des structures échantillonnées par les simulations de dynamique moléculaires sous contraintes ambiguës.

Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 70. Les structures respectant la topologie native du réseau de liaisons hydrogènes sont prédites comme ayant une énergie plus faible que les autres structures générées, ce qui traduit une stabilisation. Plus précisément, l’énergie libre du complexe est estimée à moins de 50kCal.mol-1 lorsque cette topologie est native, alors que ce seuil n’est pas franchi lorsque les topologies alternatives sont explorées.

figure 70 : Evaluation des structures générées au cours de la dynamique par la fonction d’énergie Foldef. Pour plus de clarté, la courbe est lissée avec une fenêtre de 9 structures (4 structures en amont et 4 en aval).

On constate donc que la topologie native est correctement discriminée : les différences d’énergie libre entre ces différentes structures sont faibles mais significatives au regard de la marge d’erreur de la fonction d’énergie FOLDEF (0,80 kCal.mol-1).

6.4.3 Deuxième question : peut-on appliquer cette stratégie dans le cadre d’un criblage in silico ?

La stratégie utilisée pour générer les 30 dynamiques du domaine FHA N-terminal de Rad53 complexée à un peptide pTxxD a été repétée pour chacun des 19 acides aminés substitués en position pT+3, en appliquant le même algorithme de génération de contraintes ambiguës. Cette opération coûteuse en temps n’aurait pas été réaliste sans que la protéine ne soit rigidifiée sur les régions éloignées de l’interface et sans que la solvatation explicite ne soit restreinte à cette même région. Les dynamiques obtenues ont été évaluées avec la fonction d’énergie FOLDEF. La table 23 présente les résultats complets de cette évaluation.

motif criblé in silico score Foldef de la meilleure des 30 simulations ∆∆G avec le motif pTxxA pTxxA 47,90 0,00 pTxxC 49,10 1,20 pTxxD 49,96 2,06 pTxxE 47,55 -0,35 pTxxF 49,02 1,12 pTxxG 49,28 1,38 pTxxH 47,51 -0,39 pTxxI 47,53 -0,37 pTxxK 49,61 1,71 pTxxL 47,73 -0,17 pTxxM 49,84 1,94 pTxxN 49,02 1,12 pTxxP 50,31 2,41 pTxxQ 47,59 -0,31 pTxxR 49,77 1,87 pTxxS 48,14 0,24 pTxxT 49,47 1,57 pTxxV 50,70 2,80 pTxxW 48,84 0,94 pTxxY 47,57 -0,33

table 23 : Résultat du criblage virtuel des différents phospho-peptides. L’exploration conformationnelle a été effectuée par simulation de dynamique moléculaire, sous contraintes ambiguës et dans une bulle d’eau. Les structures générées au cours de ces différentes dynamiques ont été évaluées par la fonction d’évaluation Foldef. Pour chaque phospho-peptide criblé, 30 simulations ont été effectuées. Les résultats présentés ici sont ceux de la meilleure dynamique.

Les résultats obtenus sont décevants puisqu’on constate que la quasi-totalité des autres peptides sont prédits comme plus affins que le peptide pTxxD. Seuls deux peptides sont estimés par Foldef comme moins favorables : il s’agit des peptides pTxxP (50,31 kCal.mol-1) et pTxxV (50,70 kCal.mol-1).

Ce résultat peut s’expliquer par le fait que de multiples interactions à l’interface entre le domaine FHA et son peptide contribuent à la valeur de l’énergie estimée. Dans le cas du peptide TxxD, la structure de plus basse énergie correspond bien à l’interaction native entre l’aspartate en position pT+3 et l’arginine 83. Néanmoins, cette conformation a été rarement explorée et il est possible que dans les autres zones de cette interface, des interactions défavorables aient contribué à réduire la stabilité. Pour pallier à ce problème, il faudrait explorer de façon approfondie les interfaces pré-sélectionnées lors d’un premier crible comme celui présenté figure 70. En termes de temps de calcul, cette solution risque de devenir rapidement prohibitive car elle suppose un processus itératif dans lequel le poids de

Cette stratégie utilisant des contraintes ambiguës dont la force est modulée itérativement en fonction de l’énergie des modèles générés à l’itération précédente est désormais couramment utilisée dans les programmes de résolution des structures par RMN (Linge et al., 2003). Néanmoins, pour que cette approche soit envisageable, il sera nécessaire d’échantillonner plus efficacement les solutions proches de la conformation native.