Mise au point d’un protocole de purification des protéines

La purification des protéines a été réalisée à partir d’une solution standard à 35 µg.mL-1. Un volume de 375 µL de solution a été utilisé pour toutes les procédures étudiées. Cen vingt-cinq microlitres de TCA à 100 % a été alors ajouté pour précipiter les protéines (concentration finale de TCA dans le tube est égale à 25 %). Le mélange a été agité au vortex puis les protéines ont été précipitées pendant une nuit à -20 °C. Les tubes ont ensuite été centrifugés à 16600 g pendant 15 min à 4 ° C. Le surnagent a été éliminé délicatement afin d’éviter toute perte de protéines durant l’étape de pipetage. Le culot protéique a été repris dans 500 µL de solvant de lavage : acétone, éthanol ou éthanol/HCl. Les échantillons ont été ensuite incubés pendant 1h00 à -20 °C avant d’être centrifugés à 16600 g pendant 15 min à 4 ° C. Le surnagent a été à nouveau éliminé délicatement, transféré dans un autre tube puis évaporé sous vide à l’aide du concentrateur Speedvac.

Les protéines ont enfin été solubilisées dans 100 µL de tampon d’analyse, 50 mM de bicarbonate d'ammonium contenant 10 mM de Tris après évaporation totale du solvant de lavage, puis quantifiées soit par dosage Bradford et électrophorèse monodimensionnelle (1D), soit par UPLC-HRMS/MS.

2.3.1. Quantification des protéines par dosage de Bradford et électrophorèse monodimensionnelle (1D)

La quantité de protéines totales (40 µL de l’échantillon purifié) a été déterminée selon la méthode Bradford (DC Protein Assay kit, Bio-Rad). Pour l’électrophorèse 1D, un volume de 25 µL d’échantillon a été déposé sur un gel Novex © Tris-glycine, 10 % de polyacrylamide (Invitrogen) puis soumis à une tension constante de 70 mV. Les protéines ont ensuite été visualisées après coloration au nitrate d’argent. Brièvement, les gels ont été trempés dans une solution de fixation contenant 50 % de méthanol, 10 % d'acide acétique et 100 mM d'acétate d'ammonium avant d’être rincés à l’eau (2 fois). Pour la révélation des protéines, les gels ont d’abord été incubés pendant 15 min dans de thiosulfate de sodium à 0,005 %, puis 15 min dans le nitrate d’argent à 0,1 %. Le développement de la coloration (2 min) a été réalisé en présence

129 du formaldéhyde à 0,036 % et du carbonate de sodium à 2 %. La réaction a été stoppée avec une solution d’EDTA à 50 mM. Le traitement des images obtenues après électrophorèse a été réalisé à l’aide du logiciel ImageJ.

2.3.2. Quantification des protéines par UPLC-HRMS/MS

Les protéines ont été solubilisées dans 100 µL de tampon d’analyse, puis diluées au 1/3 en utilisant le même tampon et enfin digérées avec de la trypsine. Un volume de 1 µL d’une solution à 1 mg.mL^-1 de peptides standards a été ajouté. À partir de 100 µL d’échantillon, 10 μL de DTT à 15,4 mg.mL-1 ont été additionnés. Les échantillons ont été ensuite incubés à 60 °C pendant 1h00. Dix microlitres d’iodoacetamide à 44,4 mg.mL^-1 ont été ajoutés, puis les échantillons ont été placés dans le noir pendant 45 min à température ambiante. Une fois les 45 min écoulées, 100 μL de 50 mM de bicarbonate d'ammonium contenant 10 mM de Tris ont été ajoutés. Enfin, les protéines ont été digérées par la trypsine avec un ratio trypsine/protéine (w/w) égal à 1/6, avant d’être analysées par UPLC-MS/MS. La digestion a été réalisée pendant 24h00 à 37°C. L’activité de la trypsine a été stoppée par de l’acide formique à 0,4 % (concentration finale).

2.3.3. Analyses statistiques

Afin de comparer les rendements de purification à partir des solutions standards de protéines, une analyse de la variance (ANOVAs) a été réalisée suivant un risque α de 5 % avec le logiciel XL-Stat (Addinsoft, Paris, France).

2.3.4. Spectrofluorométrie

Les mesures de fluorescence ont été réalisées avec un spectromètre de type Fluoromax-4 spectrophotometer (HORIBA Scientific, Kyoto, Japan) qui permet d’obtenir des spectres de fluorescence à trois dimensions (3D). L’échantillon a été placé dans une cuve en quartz, de trajet optique 1 cm, puis introduit dans un compartiment thermostaté à 20 °C. La source lumineuse utilisée est une lampe à arc Xénon 450 watts, émettant un rayonnement polychromatique continu dans l’UV-Visible, entre 250 et 800 nm. L’intensité de fluorescence a été mesurée en réalisant un balayage de longueur d’onde d’excitation et d’émission respectivement entre 240 à 450 nm et 260 à 600 nm par pas de 5 nm. Ce type de balayage permet ainsi d’obtenir une matrice d’émission-excitation.

130 Dans notre étude, l’acide 1-anilino-8-naphthalène sulfonate (ANS) a été choisi comme fluorophore extrinsèque. Toutes les expériences ont été réalisées dans le tampon acétate à 0,1 M (pH 5). Dans un premier temps, les spectres de fluorescence du tampon acétate (blanc), de l’ANS et des protéines seules ont été tracés. Par la suite, un volume de 500 µM d’ANS a été mélangé avec un volume de 20 µM de la protéine d’intérêt (figure 71).

Les spectres des différents échantillons ont ensuite été obtenus après soustraction du spectre correspondant au blanc.

Figure 71. Traitements successifs appliqués à la protéine sous forme native

2.3.5. Micro-spectroscopie Raman

Les analyses en micro-spectroscopie Raman ont été réalisées à l’aide d’un microscope confocal HORIBA JOBIN YVON Labram HR800UV équipé d’un détecteur CCD refroidi par effet Peltier. La longueur d’onde excitatrice est de 632,8 nm est produite par un laser He-Ne (Melles Griot). La puissance laser délivrée à l’échantillon varie de 6 à 1,5 mW (utilisation de filtres de densité optique). L’appareil est équipé d’un microscope confocal Olympus qui permet de travailler en rétrodiffusion. Un réseau de diffraction à 1800 traits.mm^-1 est utilisé et l’ouverture du trou confocal est de 200 µm. Le spectromètre est calibré avec un échantillon de silicium. Le logiciel LabSpec 5 permet l’acquisition et le traitement des résultats.

Une faible quantité d’échantillon (quelques mg) a été déposée sur une lame de verre. Les protéines natives ont été directement analysées sous forme solide. Les protéines précipitées au TCA et lavées au solvant organique (éthanol-HCl ou acétone) ont également été analysées sous

Structure A Native

Précipitation au TCA

Structure B

ANS

Lavage avec un solvant organique

131 forme solide après évaporation du solvant. Les conditions opératoires relatives à l'appareillage sont résumées dans le tableau 7.

Tableau 7. Conditions opératoires

Laser (nm) ^Filtre Trou (µm) Réseau (g/mm) ^Objectif Gamme balayée (cm-1) Temps d’exposition (s) Nombre d’acquisitions Mode d’acquisition Filtre spike 632,8 DO ou D0,6 200 1800 ^50x LMP 1150-1800 ^{180-400 4} Multiple windows Multi (auto add)

Trois protéines à une concentration de 220 mg.mL^-1, la HSA, le lysozyme ainsi que la Rnase, ont été étudiées sous forme native et après traitement avec les différents réactifs selon le schéma illustré sur la figure 72.

Figure 72. Traitements successifs appliqués à la protéine native

2.3.6. La microscopie à force atomique (AFM)

L’AFM a été utilisée afin d’avoir une image 3D de l’état molten globule induit par la précipitation au TCA. Pour cette expérience nous avons utilisé des plaques de Mica fraichement clivées, sur lesquelles nous avons déposé 30 µL d’une solution de HSA à 10 µg.mL^-1 (Marchin and Berrie, 2003). La plaque a été ensuite séchée sous flux d’azote. La HSA a été analysée à l’état natif, à l’état précipité après ajout de 10 µL de TCA (25 % concentration finale) et après lavage à l’éthanol/HCl.