Le Q-exactive

Ce type de spectromètre combine les performances d’un analyseur quadripolaire utilisé pour sélectionner les ions parents, et d’un second analyseur orbitrap qui assure une détection à très haute résolution (figure 55).

Source d’ions

Quadripôle Cellule de

collision Pusher détecteur

Reflectron Guide

d’ions

Tube de vol (TOF)

98 Figure 55. Représentation du Q-exactive (d’après Thermo Fisher)

Les ions multi-protonés générés à pression atmosphérique par une source ESI, sont dirigés vers une série de lentilles (S-lens) connectées au capillaire de transfert chauffé (275 °C, dans le cas de notre étude). Ces lentilles constituent le point d’entrée des ions vers le système et vont permettre ainsi d’accélérer, de focaliser et de transmettre les ions jusqu’au flatapôle via une lentille de sortie « Exit S-Lens ». Le processus de désolvatation se poursuit tout au long de ce déplacement par collision avec le gaz résiduel. Le flatapôle est constitué de quatre barreaux plats avec un espacement de 2 mm entre les barreaux. La courbure de ses barreaux (90 °C) favorise l’élimination des composés neutres et des gouttelettes de solvant. Les ions sont ensuite focalisés et transmis via une lentille « Lens » vers le premier analyseur, quadripôle. Celui-ci va permettre de sélectionner un ou plusieurs ions afin d’obtenir la gamme de masse désirée, généralement en protéomique entre 200 à 2000 m/z pour un « Full-scan » (Détection de tous les ions dans la gamme m/z de l’analyseur). Les ions précurseurs sont ensuite accumulés dans le piège à ions « C-Trap » ou fragmentés dans la cellule de collision (High Energy Collision, HCD), qui fonctionnement de façon synchronisée, avant d’être analysés par l’orbitrap. Les ions parents entrent en collision avec les molécules de gaz (azote), entrainant une rupture des liaisons chimiques résultant de la formation d’ions fils. L’énergie de collision appliquée est généralement comprise entre 20 et 50 eV pour la fragmentation des peptides. Avant leur détection dans l’orbitrap, les ions fragments ainsi formés sont retransmis et accélérés vers la « C-Trap », en appliquant une différence de potentiel (Michalski et al., 2011). Ainsi et contrairement au triple quadripôle qui fonctionne de manière continue, les ions sont accumulés dans la C-Trap avant analyse par l’orbitrap qui donne accès à la masse exacte des composés

Cellule de collision (CID): Fragmentation

Orbitrap: Analyseur

Source ESI: Ionisation C-Trap:

Accumulation des ions

Quadripôle: Sélection/filtration des ions

S-Lens Flatapôle

Exit S-Lens Lens

99 d’intérêt. Le Q-exactive est caractérisé par une précision sur la masse mesurée inférieure à 1 ppm (tableau 5), ce qui lui permet de différencier deux ions avec un m/z très proches (exemple : 400,04965 et 400,04930 (0,00035 Da)).

L’orbitrap a été développé dans les années 2000 par Alexander Makarov (Makarov, 2000). Il est constitué d’une électrode externe creuse à l’intérieur de laquelle est placée coaxialement une électrode interne centrale en forme de fuseau. Les ions sont injectés en paquet tangentiellement à l’électrode interne au moyen d’interstices situés sur l’électrode externe. Un champ électrostatique quadripolaire est maintenu entre les deux électrodes permettant de piéger les ions autour de l’électrode centrale. Chaque ion entrant dans ce piège aura à la fois un mouvement circulaire autour de l’électrode, ainsi qu’un mouvement axial le long de cette électrode (figure 56).

Figure 56. Représentation schématique de l’analyseur orbitrap (Zubarev and Makarov, 2013)

Les oscillations axiales des ions avec une fréquence f, dépendent particulièrement du rapport m/z (Hu et al., 2005; Makarov et al., 2009). Les courants induits par les oscillations des ions entre les deux électrodes, sont ensuite amplifiés et convertis par transformée de Fourrier. Il en résulte alors la masse et l’intensité des ions, formant ainsi un spectre de masse (Hu et al., 2005; Makarov et al., 2009; Scigelova and Makarov, 2006).

L’orbitrap connait un réel engouement dans le domaine de la protéomique. En effet, cette technologie a révolutionné l’analyse par spectrométrie de masse et s’est imposée très rapidement pour l’analyse des macromolécules biologiques. En grande partie grâce à ses performances techniques, un tel analyseur permet d’atteindre une résolution d’environ 100 000 (m/z= 200) et une précision sur la mesure de masse inférieure à 2 ppm (Scigelova and Makarov,

Arrivée des ions

Tension

Amplificateur

Signal détecté

100 2006). Le tableau 5 résume les principales caractéristiques techniques des analyseurs de masse utilisés actuellement en protéomique.

Les différents modes d’acquisition du Q-exactive

Le Q-exactive est adapté aussi bien aux analyses non ciblées (« full Scan ») pour l’identification de l’ensemble des protéines présentes dans un échantillon donné, qu’aux analyses semi-quantitatives et ciblées de type PRM « parallel reaction monitoring » (Ronsein et al., 2015; Schiffmann et al., 2014). Le mode balayage « Full Scan », permet la détection de tous les ions dans la gamme m/z sélectionnée par le quadripôle. Ce mode fournit une grande quantité d’information sur l’échantillon analysé. Le mode PRM (figure 57) très sélectif, repose sur la sélection de l’ion précurseur cible dans le quadripôle et de sa fragmentation dans la cellule de collision. Ainsi, les ions fragments générés sont ensuite transférés vers l’Orbitrap via la C-Trap. Il est alors possible d’identifier le rapport m/z de l’ion parent (m/z)1 et celui de l’ion fils (m/z)2. Par ailleurs, il est aussi possible de suivre de façon simultanée plusieurs transitions PRM et de réaliser ainsi un multiplexage dans le but d’analyser différents peptides d’intérêts (Shi et al., 2016). À ce jour le mode PRM présente de nombreux avantages par rapport au mode SRM (Shi et al., 2016). En effet, il a été démontré récemment que les performances analytiques pour la quantification de 35 peptides introduits dans un échantillon d’urine sont meilleures en mode PRM. Ainsi, ce mode a permis d’atteindre des limites de quantification plus faible pour 61 % des transitions par rapport au mode SRM du triple quadripôle (Gallien et al., 2013).

Figure 57. Principe du mode PRM (Aebersold and Mann, 2016)

Grâce à ce mode PRM, Kim et al. (2016), ont développé une approche multiplexe sur un Q-exactive, pour la quantification des tyrosines kinases (PTKs) (Kim et al., 2016).

C-Trap

Trajectoire des ions

Orbitrap Quadripôle 1 2 3 Cellule de collision 1 2

3 Analyse des ions fragments

Sélection de l’ion précurseur

101 De nouveaux modes d’acquisition des données en protéomique sont en plein développement avec l’essor de la technologie Q-orbitrap. Le mode data dependent acquisition (DDA) et le mode data independent acquisition (DIA). Ces modes d’acquisition concernent soit la sélection des ions précurseurs en fonction de leur intensité pour produire leurs spectres de fragmentation (fragmentation successive des ions) (DDA), soit la fragmentation de l’ensemble des ions précurseurs au cours de l’analyse (DIA) (Aebersold and Mann, 2016; Gillet et al., 2016).

Pour le mode DDA, les spectres MS et MS/MS sont générés de façon cyclique. Lors de l’élution des ions peptides, une succession de scan MS et MS/MS est alors établie. Un scan MS est généralement suivi de plusieurs scans MS/MS sous la forme d’un TopN (N signifie le nombre d’ions précurseurs les plus intenses pouvant être fragmentés). Concernant le mode DIA, tous les peptides élués sont fragmentés en même temps sans aucune sélection préalable de l’ion précurseur. Ainsi, la fragmentation des ions précurseurs transmis à l’analyseur peut être réalisée de façon simultanée ou par fenêtre réduite d’environ 25 m/z (Aebersold and Mann, 2016; Shi et al., 2016). La figure 58 récapitule les différents modes d’acquisition des données MS/MS.

Figure 58. Les différents modes d’acquisition des données protéomiques. L’analyse des données est réalisée au moyen de logiciels dédiés à chaque mode d’acquisition (d'après

Aebersold and Mann, 2016)

Bruderer et al. (2015), ont comparé les données de quantification générées par un Q-exactive entre deux analyses, réalisées en mode DDA et en mode DIA. Cette étude a montré que le mode DIA permet de gagner en sensibilité et en reproductibilité par rapport au DDA. Cette étude a permis d’établir un profil protéique de tissus de foie humain traités au paracétamol (Bruderer et al., 2015). Digestion Protéine Peptides Préparation de l’échantillon DIA DDA Ciblée SRM Q3 Q2 Q1 TOF ou orbitrap Cellule de collision Q Q ^C-trap Orbitrap ou TOF

Analyse des données et interprétation

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