La microscopie optique et plus précisément la microscopie d’imagerie en temps de vie de fluorescence (FLIM) a été particulièrement utile tout au long de ce projet. À l’aide de cette technique, nous avons été en mesure d’analyser les temps de vie des nanocoquilles fluorescentes. Afin de comprendre les résultats des prochains chapitres et de justifier le choix d’une telle technique, nous devons tout d’abord comprendre les principes généraux de la microscopie optique.
La microscopie optique, regroupe un ensemble de techniques d’imagerie dont le but est de magnifier un objet normalement invisible à l’œil nu. En général, ces techniques utilisent des longueurs d’onde dans la région du spectre visible ou légèrement au-delà. De ce fait, il est possible d’observer directement l’échantillon magnifié à l’aide d’ocu- laires, sans utiliser de caméra. Bien sûr, la plupart des microscopes peuvent aussi faire l’acquisition d’images à l’aide de caméra.
Le principe de la microscopie est d’utiliser une source visible qui est projetée sur un échantillon déposé sur un support. La lumière qui interagit avec la matière sera récoltée par l’objectif du microscope. Grâce à l’objectif, l’image sera magnifiée et dirigée vers l’oculaire qui permet l’observation directe de l’échantillon, ou être envoyée vers des ports externes pour être captée par une caméra ou d’autres types de détecteurs. La figure 2.3
présente les différents parcours optiques possibles dans un microscope optique inversé comme celui utilisé dans ce projet. L’avantage de ce type de microscope est qu’il est
possible d’utiliser différentes sources d’illumination comme une lampe halogène, une lampe à décharge au xénon ou bien des lasers. La présence de plusieurs ports d’entrée et de sortie en fait un instrument très versatile. Dans ce projet, le port latéral sera utilisé de manière simultanée comme entrée pour la source laser et comme sortie afin de diriger le signal fluorescent vers un système de détection pour mesurer la fluorescence résolue dans le temps. La conception du microscope d’imagerie en temps de vie de fluorescence sera vue en détail à la section 2.3.2.
Figure 2.3 – Parcours optique des différents ports d’un microscope inversé IX-71 d’Olympus(3).
L’objectif du microscope est formé d’un ensemble de lentilles servant à magnifier les structures en observation. La capacité de l’objectif à capter la lumière est fonction de son ouverture numérique (NA) tel que présenté à la figure 2.4. L’ouverture numérique est proportionelle à l’angle µ formé par le cône de lumière de l’objectif. Une grande NA a pour effet d’améliorer la collecte de lumière ainsi que d’obtenir une meilleure résolution à une distance donnée. Même à très haute magnification, l’image est limitée par le pouvoir résolutif du système optique. Celui-ci se définit par sa capacité à différencier deux objets situés à proximité l’un de l’autre. Le pouvoir résolutif dépend de la longueur d’onde d’excitation (λexc) utilisée et de l’ouverture numérique de l’objectif (NA)(4) et
est défini par l’équation suivante(5) :
rlatérale = 0, 51λexc
Le faisceau focalisé sur l’échantillon est limité par la diffraction. Le patron de diffraction formé au point focal se nomme tache d’Airy. Comme représenté à la figure 2.4, lorsque les taches d’Airy de deux objets à proximité se recouvrent, il sera impossible de résoudre l’image de ceux-ci.
Figure 2.4 – Représentation de l’ouverture numérique (NA) d’un objectif de microscope et de la résolution en fonction du disque d’Airy(6).
La résolution latérale du microscope représente la distance de séparation minimale afin de résoudre deux objets. La résolution axiale, elle, dépend aussi de λexc et de NA mais
également de l’indice de réfraction du médium (n)(5) comme présenté à l’équation2.2.
raxiale = 0, 88λexc
(n −√n2− N A2) (2.2)
En général, la résolution axiale obtenue est inférieure à la résolution latérale. En équi- pant le microscope d’un filtre spatial confocal, il est possible d’augmenter la résolution axiale. Cette technique particulière est associée à la microscopie confocale à balayage laser et sera présentée plus en détail à la section suivante.
2.3.1 Microscopie en épifluorescence
Contrairement à la microscopie à champ clair (à transmission), l’image formée par la microscopie de fluorescence ne provient pas de la lumière occultée par l’échantillon. Afin d’imager l’échantillon, on se sert de la fluorescence intrinsèque émise par des matériaux lorsqu’excités par une source. Dans le cas particulier de l’épifluorescence, la source d’excitation et le signal de fluorescence passent par l’objectif tel que présenté à la figure
2.5. L’objectif du microscope sert ainsi à la fois de condenseur afin d’exciter l’échantillon et d’objectif afin de récolter le signal de fluorescence.
Figure 2.5 – Représentation du parcours optique avec l’ensemble des filtres pour la microscopie de fluorescence. a) Parcours détaillé de l’excitation b) Ensemble des pièces pour la microscopie de fluorescence c) Parcours détaillé de l’émission.(7)
La source généralement utilisée en fluorescence est une lampe à décharge au xénon. Le faisceau de la source est amené vers un cube de fluorescence afin de n’en garder qu’une bande étroite de longueurs d’onde concordant à celle de l’excitation du fluorophore (voir fig : 2.6). Le cube muni d’un miroir dichroïque permet de refléter la lumière de l’excitation et de laisser passer les longueurs d’onde au-dessus d’un certain seuil, comme le signal fluorescent. Celui-ci, représenté aux figures 2.5 et 2.6, permet à la source filtrée d’être réfléchie vers l’objectif pour exciter l’échantillon. Suite à l’émission de la fluorescence, le signal est redirigé vers le cube pour passer au travers du miroir dichroïque. Ensuite, un filtre de fluorescence est souvent utilisé afin d’empêcher les photons résiduels provenant de lumière parasite d’entrer dans le système de détection.
Figure 2.6 – Spectre de transmittance des différentes composantes d’un cube de fluo- rescence avec le spectre de la fluorescéine.(8)
Le système de détection utilisé dépend de l’application visée. Dans le cas de la microsco- pie en épifluorescence, l’image formée peut être simplement observée avec les oculaires du microscope ou bien captée à l’aide d’une caméra. Lorsqu’on utilise un microscope confocal à balayage laser, il est possible de produire des images à l’aide du système de détection, mais aussi de faire l’acquisition de données spectroscopiques locales telle que la spectroscopie de fluorescence à l’état stationnaire et la spectroscopie de fluorescence résolue dans le temps.
Microscope confocal à balayage laser
La microscopie confocale à balayage laser (MCBL) est une technique spécialisée de la microscopie de fluorescence. Au lieu d’utiliser une lampe xénon comme source, et d’illu- miner l’échantillon en champ large, un laser est focalisé par l’objectif sur la surface. Le fait de focaliser le faisceau laser en un point limité par la diffraction nous permet d’obtenir une grande densité de puissance. Cet aspect devient crucial lors d’acquisi- tions de données sur des échantillons faiblement fluorescents. Le faisceau laser balaye l’échantillon grâce à une platine à déplacement piézoélectrique ou galvanométrique, ou bien d’un disque troué de type Nipkow(4). Le système d’acquisition prend en compte
le déplacement du faisceau et reconstitue une image pixel par pixel. Un des avantages d’utiliser la MCBL est que le filtre spatial permet d’obtenir une profondeur de champ très étroite, rejetant ainsi la lumière parasite émanant hors du plan focal. Le fonction- nement du filtre spatial est présenté à la figure 2.7. Le signal de l’échantillon émerge de
l’objectif sous la forme d’un faisceau collimaté qui est envoyé vers le système de détec- tion. Avant de se rendre au détecteur, le faisceau est focalisé dans un sténopé de la taille de la tache d’Airy. La lumière qui était hors champ n’est pas focalisée à la position du sténopé et est ainsi bloquée. Le signal transmis par le filtre spatial est ensuite redirigé vers le détecteur.
Filtre spatial confocal Sténopé
Trajet laser excitation Trajet fluorescence point focal
Trajet fluorescence hors plan Source laser Échantillon Dichroïque Objectif Détecteur
Figure 2.7 – Shéma du fonctionnement d’un filtre spatial (confocal)(8).
Selon l’application, il est possible d’utiliser plusieurs détecteurs simultanément afin d’obtenir une plus grande richesse d’informations spectroscopiques en une seule ac- quisition. Entre autres, en utilisant plusieurs détecteurs, il est possible de séparer les longueurs d’onde provenant de structures marquées avec différents fluorophores. Dans ce projet, deux détecteurs de type photodiode à avalanche à photon unique (SPAD) vont nous permettre de faire l’acquisition simultanée des temps de vie de la fluorescéine et de la rhodamine B.
La microscopie confocale à balayage laser permet d’obtenir une meilleure résolution axiale en bloquant les signaux hors champ. Les nanoparticules étudiées dans ce projet ont une taille bien plus faible que la profondeur de champ du microscope confocale. L’utilisation d’un filtre spatial peut sembler superflue, cependant en éliminant la lu- mière parasite, le ratio signal sur bruit devient meilleure. Dans le cas de nanoparticules faiblement luminescentes, la suppression du signal parasite ambiant aide à obtenir des temps de vie fiables.
2.3.2 Microscopie FLIM
La microscopie d’imagerie en temps de vie de fluorescence (FLIM) regroupe l’ensemble des techniques de microscopie décrites dans cette section, mais aussi celle de la spec- troscopie de fluorescence résolue dans le temps présentée à la section 2.2.2. À l’aide du
système à balayage laser, il est possible d’obtenir le temps de vie local de fluorophores à l’état excité. En balayant la surface, une cartographie en intensité et en temps de vie sera formée. Ainsi chaque pixel de l’image sera encodé de ces deux informations. Étant donné que le temps de vie de fluorescence est sensible à l’environnement local, spar exemple le pH, l’hydrophobicité du système et la présence d’agents d’inhibition de fluorescence, il permet donc de sonder les microenvironnements(9). Par exemple, à
la figure 2.8, il est possible de voir une cellule portant une mutation lui permettant d’exprimer une protéine fluorescente verte (GFP) et déposée sur un substrat d’or. À l’aide du FLIM, le groupe de Cade et al.(10) a pu démontrer que le temps de vie des
GFP était accéléré en s’approchant de la surface plasmonique et qu’il y avait une plus grande intensité de fluorescence.
Figure 2.8 – Image FLIM d’une cellule sur un film d’or (a) schéma de l’expérience (b) image en intensité de fluorescence (c) image FLIM du temps de vie moyen de la GFP(10)(barre d’échelle : 5 µm)
Le montage utilisé pour le FLIM est présenté à la figure 2.9. En utilisant le principe de fonctionnement de la TCSPC décrit à la section 2.2.2, une diode laser à 485 nm et pulsée à 10 MHz (PicoQuant GmbH, modèle LDH P-C-485) est injectée dans le mon- tage à la position 1. Au même moment, le module électronique de comptage TSCPC (PicoQuant GmbH, modèle PicoHarp 300) reçoit le signal de départ. À la position 2, le faisceau passe par un cube de fluorescence composé d’un filtre passe bande 480/40 nm et d’un miroir dichroïque qui réfléchit les longueurs d’on en dessous de 495 nm. Ainsi, l’excitation laser est réfléchie vers le microscope inversé IX-71 d’Olympus, comme celui présenté à la figure2.3. Un objectif 60x (Olympus, modèle UPLSAPO60XW) focalise la lumière sur l’échantillon qui est placé sur une lamelle de verre. Le balayage de la région
d’intérêt s’effectue par le déplacement nanométrique d’une platine piézoélectrique (Phy- sik Instrumente (PI), modèle P-517). Le logiciel Symphotime de PicoQuant enregistre pour chaque position les informations de temps de vie et d’intensité de fluorescence pour en reconstruire l’image à la fin de l’acquisition. L’objectif capte les photons émis par l’échantillon et les redirige vers le système de détection montré à la figure 2.9. Au lieu d’être réfléchis par le miroir dichroïque à la position 2, les photons de fluorescence qui sont au-dessus de 495 nm passent au travers de celui-ci pour se rendre au filtre spatial (position 3). Muni d’un sténopé de 50 µm, le filtre bloque la lumière parasite provenant des plans hors focus. Les photons de fluorescence provenant de la fluorescéine et de la rhodamine B sont séparés par un autre cube de fluorescence placé en position 4. Celui-ci est composé d’un miroir dichroïque qui reflète les longueurs d’onde en dessous de 565 nm et transmet celles au-dessus. De cette manière, l’émission de la fluorescéine sera captée par le détecteur 5,1 et celle de la rhodamine B par le détecteur 5,2. Lorsque les détecteurs de type photodiode avalanche à simple photon (SPAD) (Micro Photon Devices, modèle PDM) vont détecter un photon, un signal d’arrêt sera envoyé au mo- dule TCSPC afin de comptabiliser le temps de transition de l’événement. Ainsi, des millions d’événements seront comptabilisés et placés dans l’histogramme en fonction de leur position et de leur temps de vie au cours de l’acquisition.
Figure 2.9 – Montage optique du système de détection du FLIM
fluorescentes. Bien que l’acquisition et le traitement des données sont plus fastidieux en microscopie que lorsque celles-ci sont prises en solution, le FLIM offre l’avantage d’une plus grande densité de puissance d’excitation et de pouvoir effectuer des analyses sur des échantillons non solvatés. Dû au fait que les échantillons avec une coquille métal- lique sont faiblement fluorescents, la grande densité de puissance qu’offre le faisceau laser focalisé permet une excitation plus efficace des nanoparticules. De plus, les nano- particules ont le désavantage de relarguer lentement des fluorophores en solution ; en effectuant les analyses sur un substrat de verre à sec, l’intégrité des structures était conservée tout au long des analyses. Ces aspects particuliers ainsi que la description détaillée de la procédure d’acquisition et de traitement des données seront discutés plus amplement dans la section de la méthode expérimentale 4.6.2.
2.4
Microscopie électronique
Les structures étudiées dans cette thèse sont de dimension plus petite que la limite de résolution pouvant être atteinte par la microscopie optique standard. Afin de pallier à cette limitation, la microscopie électronique est utilisée. La microscopie électronique à transmission (MET) et à balayage (MEB) permet d’atteindre une résolution subna- nométrique et de caractériser la morphologie des nanoparticules à chaque étape de la synthèse.
2.4.1 MET
L’avantage d’utiliser les électrons comme source provient de leur longueur d’onde très courte (≈ 2 pm) et de leur forte interaction avec les atomes(11). De ce fait, les électrons
vont offrir une résolution environ 1000 fois meilleure que les photons. La microscopie électronique à transmission (MET) donne une image sous forme de contraste entre les différentes densités atomiques des matériaux observés. Cet aspect est particulièrement pratique dans ce projet afin de caractériser la structure multicouche composée de silice et d’or.
Le principe de fonctionnement du microscope électronique est semblable à celui du microscope optique. Une source (généralement un filament de tungstène) émet des électrons qui sont accélérés et dirigés par un système de lentilles électromagnétiques. Le faisceau d’électrons frappe l’échantillon et une partie des électrons est absorbée ou diffusée par la matière. Sous l’échantillon, une caméra CCD est placée de manière à imager les électrons qui n’ont pas interagi avec l’échantillon(12).
L’utilisation de l’électron comme source d’illumination augmente la complexité de l’ap- pareillage. Les lentilles électromagnétiques doivent être contrôlées par des modules élec- troniques coûteux. Les appareils doivent être sous vide afin que le faisceau d’électron ne soit pas dévié par les molécules gazeuses. De plus, la taille maximale permise du spécimen est restreinte, car le porte-échantillon ainsi que la chambre d’observation sont limités par des supports sous forme de grilles de quelques millimètres de diamètre. Les orifices de ces grilles servent de fenêtres d’observation et sont recouverts d’une mince couche d’une matière peu absorbante qui supporte l’échantillon. Selon la densité du spécimen, les électrons sont plus ou moins transmis. De ce fait, l’épaisseur maximale de l’analyte est contrainte par la densité de la matière.
2.4.2 MEB
La microscopie électronique à balayage est munie d’un système d’illumination similaire à celui du MET, cependant son faisceau d’électrons est focalisé sur l’échantillon afin d’en balayer la surface. Lorsque les électrons de la source entrent en contact avec la matière, les collisions inélastiques entre les atomes et la source produisent l’éjection d’électrons secondaires. Due à la faible énergie de ces électrons, l’observation est limitée à la surface superficielle de l’échantillon, n’atteignant que quelques nanomètres de profondeur. Les électrons émis sont capturés par un détecteur chargé de type Everhart-Thornley. En balayant le faisceau sur la surface de l’échantillon, l’appareil peut reproduire une image de la surface.
Tout comme le microscope électronique à transmission, le MEB est opéré sous vide. Cependant, le faisceau focalisé peut charger la surface de l’échantillon et réduire énor- mément la qualité d’image. Pour contrer cet effet, l’échantillon doit être conducteur afin de permettre une mise à la terre. Dans le cas d’échantillons non conducteurs, il est possible de déposer une mince couche d’or afin de permettre à la charge de se dissiper vers la mise à la terre. Certains MEB peuvent imager des échantillons non conducteurs sous certaines conditions. L’appareil doit opérer sous vide partiel et une quantité infime de vapeur d’eau est injectée dans la chambre. Les collisions entre les molécules d’eau et la surface chargée permettent de réduire l’accumulation de charges. Cependant, la réso- lution et la qualité d’image sont nettement inférieures en comparaison à un échantillon conducteur sous vide élevé.
Cette technique de microscopie est parfaitement adaptée afin d’imager la topographie de nanostructures. Le MEB a été utilisé pour observer l’aspect de surface de la coquille
métallique. Notamment, lors de l’optimisation de la synthèse, le profil irrégulier des îlots de croissances a été caractérisé avec ce type de microscopie. Les échantillons en solution étaient déposés directement sur des substrats de silicium afin de réduire l’effet de charge sur les nanostructures.
Au cours de ce projet, la microscopie électronique en transmission à balayage (METB) a aussi été utilisée. Ce type de microscopie hybride entre le MET et MEB est utilisé dans le cadre d’analyses élémentaires comme la spectroscopie de dispersion énergétique de rayon X (EDX) et la spectroscopie de perte d’énergie d’électrons (EELS). L’EDX permet de recueillir des informations sur les atomes composant la matière. Lorsqu’un électron de la source éjecte un électron de cœur, un électron de la couche supérieure vient prendre sa place en émettant un rayon X(13). L’énergie entre les deux niveaux est spécifique à
chaque type d’atome, ce qui permet leur identification. Le EELS analyse les pertes d’énergie de la source d’électron qui est associée à des interactions de type inélastique. Ce type d’interaction est caractéristique à l’excitation de phonons, les transitions entre couches électroniques et l’excitation de plasmon(14).
Grâce au balayage de l’échantillon par le faisceau d’électrons, ces techniques d’analyse permettent d’obtenir des informations extrêmement localisées. Il est possible d’utiliser l’appareil en mode d’imagerie en champ sombre annulaire (ADF). Dans cette confor- mation, ce sont les électrons diffusés par la matière qui sont imagés. En utilisant ce mode d’imagerie, il est possible de faire des analyses EDX et EELS. Les images formées ont un contraste inversé en comparaison au MET. Dans cette thèse, les images METB montrées n’ont pas d’information spectroscopique provenant d’analyses EDX ou EELS. Cependant, l’excellent contraste d’image permet de mieux voir les sillons formés par les îlots de germes d’or et la jonction entre deux nanocoquilles sous forme de dimère (voir chap :4).