MESURES DES PARAMETRES GLOBAUX

2.3.1 Mesures des gaz par µCPG

La composition et la pression du ciel gazeux ont été mesurées en continu par micro-chromatographie en phase gazeuse multiplexée (µCPG R3000, SRA instrument), qui permet le suivi simultané de 12 à 20 fioles (Figure 2-5). Le µCPG est composé d’un injecteur chauffé à 90°C et de deux colonnes capillaires à 80°C. La première colonne est une MolSieve 5Å (avec une longueur de 10 m et un diamètre de 0,32 mm) permettant de séparer le dioxyde de carbone du reste du gaz et qui utilise l’argon comme gaz vecteur (pression de 30 psi). La deuxième colonne est une PLOT Q (avec une longueur de 8m et un diamètre de 0,32 mm) séparant l’oxygène, l’hydrogène, l’azote et le méthane avec l’hélium comme gaz vecteur (pression de 20 psi). La détection des gaz est assurée par un micro-catharomètre (µTCD) détecteur à conductivité thermique.

Tout d’abord, l’appareil mesurait la pression dans la fiole. Si celle-ci était supérieure à 1 550 mbars, le µCPG dégazait la fiole avant de réaliser l’analyse de la composition du ciel gazeux. Puis après l’analyse, la pression était de nouveau mesurée. Si la pression dans la fiole était inférieure à 0,95 bars, la composition du ciel gazeux n’était pas analysée afin d’éviter des contaminations entre fioles. A ce moment-là, la composition du ciel gazeux était mesurée manuellement en utilisant un chromatographe en phase gazeuse non automatique (CPG) (c.f. 2.3.2 Mesures des gaz par CPG). Les quantités de gaz mesurés ont ensuite été ramenés à des conditions standards de pression et de température en utilisant la loi des gaz parfaits (Patm = 1 bar et T°= 273 K).

Figure 2-5 : Photo du micro-chromatographe en phase gazeuse multiplexé.

2.3.2 Mesures des gaz par CPG

Le chromatographe en phase gazeuse Clarus 580 contient un injecteur à 250°C et deux colonnes capillaires à 60°C. La première colonne est une RtUBond, qui permet de séparer le dioxyde

de carbone du reste du gaz. La deuxième colonne est une RtMolsieve qui sépare l’oxygène, l’hydrogène, l’azote et le méthane, en utilisant l’argon comme gaz vecteur pour les deux colonnes, à un débit de 31,7 ml.min^-1 et une pression de 350 kPa. Le chromatographe CPG Clarus 580 est équipé d’un détecteur à conductibilité thermique (TCD) à 150°C. Ce détecteur réagit aux différences de conductibilité thermique entre le gaz vecteur et les composés de l’échantillon.

2.3.3 Analyse des échantillons de milieu

Les échantillons de milieu prélevés pendant les expériences correspondaient à des échantillons solides et ont été analysés afin de mesurer la matière sèche, le pH, les métabolites ou encore les communautés microbiennes selon le protocole résumé dans la Figure 2-6.

Figure 2-6 : Schéma de l’analyse des échantillons.

Mesure des métabolites, des sucres solubles et du pH

Comme le digestat était à 25% de MS, il n’y avait pas d’eau disponible suffisante pour mesurer le pH ou analyser les métabolites. Une quantité de milieu connu a donc été mélangé avec une quantité d’eau connue (avec un facteur de dilution d’ordre de 3 à 10 selon les expériences), puis placé à température ambiante pendant 30 min. Le mélange a ensuite été centrifugé à 4°C à 39 121 g pendant 20 min avec une centrifugeuse Avanti JE. La partie liquide du mélange a été récupérée. Le pH était mesuré sur cette phase à l’aide d’un pH-mètre (Eutech Instruments pH510). Enfin, une filtration avec des filtres nylon de porosité 0,2 µm a été réalisée afin de pouvoir mesurer les métabolites sur le filtrat obtenu.

Deux appareils ont été utilisés pour mesurer les métabolites. Le lactate ou l’éthanol par exemple ont été dosés par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Ce chromatographe a été composé d’un passeur automatique d’échantillons (Water 717 plus), d’une pré-colonne (Micro guard cation H refill cartbridges, Bio-rad) pour filtrer les résidus éventuels, ainsi que d’une colonne Aminex HPX-87H (300 mm sur 7,8 mm, Bio-rad), chauffée à 35°C et d’un détecteur réfractométrie.

L’éluent utilisé correspondait à une solution d’acide sulfurique à 0,005 M à un débit de 0,4 mL.min-1.

Cet instrument était calibré pour le dosage du glucose, du fructose, de l’éthanol ainsi que du lactate, de l’acétate, du propionate, du butyrate, du valérate, du caproate , du formate et du succinate. Les sucres solubles ont aussi été mesurés en utilisant cet appareil.

Pour mesurer les AGVs (acétate, propionate, isobutyrate, butyrate, isovalérate, valérate, isocaproate, caproate), une chromatographie en phase gazeuse a été utilisée. Ce chromatographe Perkin Clarus 580 est constitué d’un injecteur chauffé à 250°C, d’une colonne capillaire Elite-FFAP crossbond®carbowax® (15 m) chauffée à 200°C et utilisant de l’azote à 6 mL.min^-1 en gaz vecteur, ainsi qu’un détecteur FID chauffé à 280°C. Les échantillons ont été préparés en mélangeant 300 µL de la solution filtrée précédemment avec 300 µL d’une solution aqueuse à 1 g.L^-1 d’étalon interne (acide éthyle-2-butyrique). L’étalonnage externe du CPG a été réalisé par une solution à 1 g.L^-1 de chaque AGVs.

Analyses microbiologiques

Les analyses microbiologiques réalisées sur les échantillons de milieu réactionnel sont résumées dans le Table 2-2.

Table 2-2 : Procédure des analyses microbiologiques.

Prélèvement 0,3 g de digestat mis directement dans la glace

Stockage -20°C

Extraction d’ADN

Lyse cellulaire (tampon contenant du N-LS ) Vibrobroyage

Récupération de l’ADN par lavage au PVPP Précipitation de l’ADN à l’isopropanol

Déstructuration de l’ARN Purification de l’ARN PROMEGA Wizard® Genomic DNA Mesure de la qualité et de la

concentration en ADN Spectrométrie (Infinite NanoQuant M200, Tecan) Amplification par PCR Amorces: Bactéries et Archées et utilisation d’un

Mastercycler thermal cycler (Eppendorf)

Profils de communautés microbiennes

Illumina MiSeq System au centre de séquençage GenoToul (www.genotoul.fr) utilisant le logiciel

Mothur version 1.33.2

2.3.3.2.1 Echantillonnage

0,3 g de milieu ont été prélevé afin d’extraire l’ADN, puis mis dans de la glace afin d’obtenir une congélation plus rapide de l’échantillon. Enfin, ces échantillons ont été conservés à -20°C afin d’en extraire l’ADN.

L’extraction de l’ADN consistait tout d’abord en une lyse enzymatique des microorganismes en utilisant 500µL de tampon phosphate à pH 8 contenant 5% de N-LS (N-Lauroyl sarcosine), ajouté à l’échantillon de milieu congelé. Après une incubation de 1h à 70°C, 500 µL de billes de zirconium ont été ajoutées à l’échantillon et l’échantillon a été agité pendant 10 minutes grâce à un vibrobroyeur.

Ensuite, 15 mg de PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) ont été ajoutés (fixation des inhibiteurs de la PCR comme par exemple l’acide humique). Enfin, l’échantillon a été centrifugé afin de récupérer le surnageant, qui contenait l’ADN. Afin d’éliminer les billes de zirconium, trois cycles de lavages suivi de centrifugations en utilisant 500 µL de TENP (Tris-Cl, 50 mM ; EDTA, 20 mM ; NaCl, 100 mM ; PVPP, 1%) ont été réalisées. Une dernière centrifugation des surnageants a permis d’éliminer les suspensions où étaient les impuretés. L’ADN a ensuite été précipité en ajoutant de l’isopropanol puis a été récupéré par centrifugation. Afin de ne récupérer au final que de l’ADN, 20 µL d’une solution à 1 mg.mL^-1 de RNAse a été ajoutée suivi de 10 minutes d’incubation à 37°C afin de déstructurer l’ARN présent dans l’échantillon (Godon and Zumstein, 1997).

Enfin, l’ADN a été purifié en utilisant le kit PROMEGA Wizard® Genomic DNA. La concentration d’ADN et sa pureté ont été mesurées par spectrométrie (Infinite NanoQuant M200, Tecan), en mesurant les absorbance à 260 nm et 280 nm.

2.3.3.2.2 Amplification de l’ADN par PCR (Polymerase Chaine Reaction)

Après avoir extrait et purifié l’ADN, une PCR a été réalisée, ce qui permet de dupliquer en grand nombre des zones spécifiques de l’ADN ou de l’ARN. Pour cela, des amorces, permettant de spécifier le(s) gène(s) à amplifier ont été choisies. Les amorces choisies pour nos amplifications se trouvent dans la Table 2-3.

Table 2-3 : Amorces utilisées pour l’amplification de l’ADN.

Avec en italique les marqueurs fluorescents : 6FAM : 6-carboxyfluorescein Cibles Amorces Séquences (5’-3’) Positions Références Bactéries

Les solutions d’amplifications utilisées pour réaliser la PCR sont décrites dans la Table 2-4.

Table 2-4 : Solutions d’amplifications utilisées pour les bactéries et les archées.

Solution d’amplification (µL) Bactéries Archées

Eau 18,25 17,25

L’amplification a été réalisée par des cycles de dénaturation, d’élongation et d’hybridation. Les conditions de ces cycles sont décrites dans la Table 2-5.

Table 2-5 : Conditions d’amplification par PCR pour les bactéries et les archées en utilisant un Mastercycler thermal cycler (Eppendorf). Elongation finale 72 °C pendant 10 min 72 °C pendant 10 min

Refroidissement 4°C dans la glace 4°C dans la glace