MATERIEL ET METHODES
2.2 DISPOSITIFS EXPERIMENTAUX .1 Echelle microscopique: tests en couche mince
Conditions expérimentales
Les conditions expérimentales pour les tests d’étude de l’échelle microscopique de la digestion anaérobie par voie sèche sont résumées dans la Figure 2-2. De la paille broyée a été inoculée avec de la boue anaérobie dont la teneur en MS était comprise entre 10 et 13% après centrifugation. Tout d’abord, le mélange a été mis dans un réacteur de 3 L à double parois thermostaté à 35°C pendant 10 jours environ. L’objectif de cette pré-culture était d’homogénéiser le milieu réactionnel et d’atteindre la phase exponentielle de production de méthane. Ce réacteur a été flushé à l’azote afin d’éliminer l’oxygène présent. Une solution d’éléments trace (FeCl2 2 g.L-1, CoCl2 0,5 g.L-1, MnCl2 0,1 g.L-1, NiCl2 0,1 g.L-1, ZnCl2 0,05 g.L-1, H3BO3 0,05 g.L-1, Na2SeO3 0,05 g.L-1, CuCl2 0,04 g.L-1, Na2MoO4 0,01 g.L-1) a été ajouté pour un volume de 0,2 ml par fiole. Le rapport substrat/inoculum (en MV) a été fixé à 3 pour permettre une production importante de biogaz, tout en étant suffisamment rapide pour réaliser des expériences sur 24 jours (Li et al., 2011). Le pH a été tamponné à 8 en utilisant 0,0026 g de NaHCO3 par g de substrat (soit 0,0031 mmol de NaHCO3 par g de substrat), suivant le protocole BMP du laboratoire.
Les tests à l’échelle microscopique ont été réalisés en tests dits « couche mince », c’est-à-dire avec un milieu de moins de 1 cm d’épaisseur afin de s’affranchir des problèmes liés au transport diffusif des molécules dissoutes et solubles dans le milieu réactionnel. Le 1 cm d’épaisseur a été choisi en fonction de la littérature, en se basant sur les résultats de Staley et al., (2011), qui indique aucune accumulation de métabolites sur 2 cm de hauteur lors de la digestion anaérobie de déchets de décharge. Ce résultat laisse supposer que le transport diffusif n’a pas d’effet limitant à l’échelle du cm.
Le milieu réactionnel était donc supposé homogène, et les gaz dissous en équilibre avec la phase gazeuse. Lors des tests « couche mince », 20 g du mélange échantillonné dans le réacteur de pré-culture ont été ajoutés sous forme de couche de moins de 1cm d’épaisseur dans des fioles de 600 ml.
Tout d’abord, ces fioles ont été flushées avec de l’azote. Puis de l’hydrogène et/ou du dioxyde de carbone ont été ajoutés afin d’obtenir des atmosphères différentes, avec une pression totale constante de 1,5 bars au début des expériences (voir 2.2.1.2 Ajout de l’hydrogène et du dioxyde de carbone en couche mince en début d’expérience). Les pressions partielles testées étaient comprises entre 0 et 1,5 bars pour l’H2 et entre 0 et 1 bar pour le CO2. Les fioles ont ensuite été incubées à 35°C.
L’évolution de la composition des ciels gazeux a été suivie pendant 13 jours.
Figure 2-2 : Conditions expérimentales des tests en couche mince.
Ajout de l’hydrogène et du dioxyde de carbone en couche mince en début d’expérience
Pour atteindre les pressions partielles voulues en H2 et/ou en CO2 en début d’expérience (c’est-à-dire après flushage au N2), des ajouts de ces gaz par mesures de pressions ont été réalisés. Les pressions partielles voulues en H2 et/ou le CO2 étant élevées (Table 2-1), les gaz ont été ajoutés en deux ou trois fois selon les pressions partielles voulues.
La pression finale choisie était de 1 500 mbars, ce qui permettait des mesures automatiques à la µCPG tout en d’évitant des contaminations croisées entre échantillons. Lorsque la pression de la fiole était inférieure à la pression atmosphérique, les analyses de la composition du ciel gazeux ont été réalisées à la CPG.
L’ajout du dioxyde de carbone en début d’expérience a été fait de la même manière que l’ajout de l’hydrogène. Lorsque l’ajout de dioxyde de carbone se faisait pendant l’expérience, la pression totale a été mesurée avant et la pression partielle voulue de dioxyde de carbone a été rajoutée.
Table 2-1: Pressions partielles en hydrogène (ୌమ) et/ou de dioxyde de carbone testés lors des expériences à l’échelle microscopique.
Essais Pression partielle en H2 (mbars) Pression partielle en CO2 (mbars)
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2.2.2 Echelle mésoscopique : tests en couche épaisse
Conditions expérimentales de l’étude de la digestion anaérobie en voie sèche à échelle mésoscopique
L’objectif était de tester l’effet de l’épaisseur du milieu réactionnel sur les performances de la digestion anaérobie par voie sèche. Pour cela, de la paille broyée a été mélangée avec de la boue anaérobie (10-13% de MS après centrifugation), en utilisant les mêmes concentrations d’éléments traces et le même rapport substrat/inoculum que pour les expériences à l’échelle microscopique (voir 2.2.1.1 Conditions expérimentales). Le pH a été tamponné à 8 en utilisant 0,907 mg de HK2PO4 par g de substrat (0,0052 mmol de HK2PO4 par g de substrat) et 0,343 mg de KPO42- par g de substrat (0,00025 mmol de KPO42- par g de substrat), afin d’éviter un biais possible par le tampon bicarbonate (par exemple sur l’effet du CO2). Ce mélange a ensuite été introduit dans des tubes cylindriques de 8,7 cm de hauteur et de 3 cm de diamètre sur une hauteur tassée de 4,2 cm (Figure 2-3). Le ciel gazeux a été ensuite flushé à l’azote avant l’expérience. La production de biogaz a été suivie par une mesure
volumétrique du biogaz par éprouvette renversée et par des prélèvements de gaz au cours du temps analysés manuellement par GC. Cette expérience a duré 33 jours et des analyses du milieu réactionnel ont été réalisées à 8, 20 et 33 jours en sacrifiant des réacteurs (4 réplicats à chaque fois pour chaque condition). Le pH, les métabolites et les communautés microbiennes ont été analysés tous les 0,7 cm de hauteur.
Par comparaison, des fioles en couche mince ont été lancées en parallèle dans les mêmes conditions que pour les tests à l’échelle microscopique (sans l’homogénéisation dans le réacteur de 3L), avec la même masse de milieu que pour les tubes, correspondant à 15 g de milieu.
Figure 2-3 : Dispositif expérimental de l’étude de la digestion anaérobie par voie sèche à l’échelle mésoscopique.
Schéma à gauche et photo à droite.
Conditions expérimentales de l’effet des gaz à l’échelle mésoscopique en digestion anaérobie par voie sèche
Le milieu a été préparé de la même manière que l’expérience précédente. Le mélange (paille, boue, tampon, élément trace) a ensuite été ajouté sur une hauteur tassée de 8 cm dans des tubes cylindriques de 20 cm de hauteur et de 3 cm de diamètre. Un espace de tête était présent en haut mais aussi en bas des tubes cylindriques (Figure 2-4). Les ciels gazeux ont été flushés à l’azote avant expérience. Au cours de l’expérience, 60 ml de gaz (N2, H2 ou CO2) ont été ajoutés tous les jours par flushage en bas des tubes cylindriques. Pour les tubes cylindriques dans lequel du N2 a été ajouté, la mesure de la production de gaz a été réalisée tous les jours avant l’ajout de gaz par mesure volumétrique par éprouvette renversée. Pour les tubes cylindriques dans lesquels de l’H2ou du CO2
ont été ajoutés, la production de gaz a été mesurée par l’évolution de la pression avec une mesure avant l’analyse des gaz et une mesure après avoir ajouté le gaz en bas du tube cylindrique. Les analyses de gaz ont été réalisées par GC en haut du cylindre puis en bas du cylindre avant d’ajouter les 60 ml de gaz en bas du tube. Une nouvelle analyse a été réalisée après l’ajout des gaz.
Cette expérience a duré 28 jours et des analyses du milieu ont été réalisées à 9, 18 et 28 jours pour les 3 conditions (3 réplicats par conditions pour chaque analyse). Le pH, les métabolites et les communautés microbiennes ont été analysés tous les cm. Cependant, aucun résultat significatif n’était visible au niveau du cm et les résultats seront présentés dans l’ensemble des tubes pour les métabolites et les microorganismes.
Figure 2-4 : Dispositif expérimental pour tester l’effet des gaz dissous sur la digestion anaérobie par voie sèche (H2 et CO2) à l’échelle mésoscopique
Schéma à gauche et photo à droite.