Mesures électroantennographiques

Les mesures de réponse antennaire des femelles de B. cucurbitae ont été réalisées avec un chromatographe en phase gazeuse du modèle 5890 (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) équipé d’une colonne DB-5 (30 m x 0,25 µm, d.i. x 0,25 µm film) (J & W Scientific, Folson, CA). La colonne se termine par un séparateur à quatre bras Graphpack 3D/2 system (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Germany). Le premier bras est relié à la colonne originelle, le deuxième bras au détecteur à ionisation de flamme (FID) et le troisième bras est dirigé à travers une ligne de transfert à l'extérieur du chromatographe vers le détecteur d’électroantennographie (EAD). Un gaz d’appoint (azote) est introduit via le quatrième bras du séparateur pour prévenir les phénomènes de condensation. Le troisième bras se termine par une chambre de mélange, à partir de laquelle un courant d'air continu, via un tube en acier inoxydable EAD (Syntech, Kirchzarten, Germany), souffle sur la préparation des antennes.

Bactrocera cucurbitae vers leurs fruits-hôtes

Pour la préparation des antennes, la femelle a été placée quelques minutes dans un tube immergé dans un bain de glace afin de limiter son activité. Ensuite, sa tête entière a été séparée du thorax avec une pince coupante. La tête a été placée entre deux électrodes de verre (Ag/AgCl), remplies d’une solution saline, connectées à un support EAG (Syntech, Kirchzarten, Germany) (Figure IV-1). La tête a été placée au niveau de l’électrode indifférente et le bout d’une des antennes est connecté par simple contact avec l’électrode d’enregistrement. Une sonde Syntech universel AC/DC a été utilisée pour enregistrer et amplifier les réponses de l’antenne.

L’analyse commence par l’injection de la fibre SPME en mode splitless (sans division du flux) dans le CG-FID. La température du four a été initialisée à 50°C pendant 2 min, puis augmentée de 7°C par minute jusqu’à atteindre 270°C et est finalement maintenue à cette température pendant 10 min. Les températures de l'injecteur et du détecteur FID ont été fixées à 200 et 260°C, respectivement. L’effluve est décomposé lors de sa migration sur la colonne du chromatographe et passe à la fois au travers de la ligne de transfert EAD jusqu’à l’antenne et dans le détecteur FID. Les signaux FID et EAD sont transférés sur un ordinateur via l’interface IDAC (Syntech) et analysés avec le logiciel GC-EAD 2000 (Syntech, version 2.5). Chaque préparation antennaire est échangée après l’injection d’une fibre SPME. Pour chaque fruit, plusieurs répétitions ont été réalisées (9 pour le concombre, 7 pour le melon et 5 pour la pipangaille lisse). Les pics FID élicitant une réponse (dépolarisation du signal EAD) pour au moins trois répétitions, ont été sélectionnés pour être identifiés par CG x CG/TOFMS. Ces pics sont caractérisés par des indices de rétention (IR-EAD, indice de rétention pour un chromatographe en phase gazeuse avec détection FID et EAD) calculés grâce à l’injection

Figure IV-1. Tête d’une femelle de Bactrocera cucurbitae connectée aux électrodes du dispositif d’électroantennographie.

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d’une série de n-alcanes (C8-C_22, Sigma-Aldrich). La tentative d’identification des composés repose sur la délimitation de zones sur les chromatogrammes du CG x CG/TOFMS avec des paramètres de rétention similaires (IR-CG) à ceux des zones EAD retenues (IR-EAD). Ainsi pour chaque zone, plusieurs composés peuvent être détectés sur le chromatogramme bidimensionnel. La présence de composés en co-élution implique une incertitude sur la nature du composé directement impliqué dans la réponse antennaire. Deux éventualités peuvent se présenter, soit plusieurs des composés de la zone sont responsables de la réponse antennaire, soit il ne s’agit que d’un seul composé. Les résultats sont donc des tentatives d’identification des composés présents dans les zones actives. Seule une injection des standards de ces composés aux antennes des insectes permettrait de vérifier l’activité du composé décelé.

I.2 Résultats

I.2.1 Concombre

Pour le concombre ‘showy green’ mature, dix zones sur le signal FID élicitant une réponse électroantennographique ont été repérées (Figure IV-2). La comparaison des indices de rétention et des spectres de masse permet de proposer des tentatives d’identification pour chacune de ces zones, dans le tableau IV-1.

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n° pic ^{Position entre}

alcanes ^IR-CG Tentative d’identification

1 C10-C11 1080 α-terpinolène 2 C11-C12 ¹¹⁰¹ 1103 (6Z)-non-6-énal nonanal* 3 C11-C12 ¹¹⁵⁴ 1154 (2E),(6Z)-nona-2,6-diénal* (3Z)-non-3-én-1ol 4 C11-C12 1161 (2E)-non-2-énal* 5 ^C11-C12 C11-C12 1170 1170 nonanol (6Z)-non-6-én-1-ol* 6 C12-C13 1291 (2Z)-tridéc-2-ène 7 C14-C15 1390 non identifié 8 C14-C15 1400 β-élémène 9 ^C14-C15 C14-C15 1451 1454 géranyl acétone* (Z)-β-farnesène 10 C14-C15 1472 α-humulène

Figure IV-2. Cycle de chromatographie en phase gazeuse (détection à ionisation de flamme ; FID) couplée à la détection électroantennographique EAD des composés volatils de concombre ‘showy green’ mature découpé utilisant des femelles de Bactrocera cucurbitae.

L’extraction des composés volatils a été réalisée par SPME (DVB-Carboxen-PDMS).

Tableau IV-1. Tentative d’identification des zones des chromatogrammes FID du concombre mature élicitant une réponse électroantennographique des femelles de Bactrocera cucurbitae par comparaison des IR-FID et IR-CG et des spectres de masse.

* composés du concombre (extraction par SPME) ayant élicité une réponse électroantennographique dans l’étude de Siderhurst & Jang (2010)

Bactrocera cucurbitae vers leurs fruits-hôtes I.2.2 Melon

Pour le melon jeune, dix zones sur le signal FID élicitant une réponse électroantennographique ont été repérées (Figure IV-3). La comparaison des indices de rétention et des spectres de masse permet de proposer une tentative d’identification pour chacune de ces zones, dans le tableau IV-2.

n° pic Position entre alcanes IR-GC Tentative d’identification

1 C10-C11 980 984 990 1-octén-3-ol β-pinène myrcène 2 C10-C11 ¹⁰³⁰ 1036 p-cymène limonène 3 C10-C11 1062 -terpinène 4 C10-C11 1080 α-terpinolène 5 C11-C12 ¹¹⁰¹ 1103 (6Z)-non-6-énal nonanal 6 C11-C12 1121 non identifié 7 C11-C12 1195 non identifié 8 C12-C13 1225 non identifié 9 C12-C13 1260 non identifié 10 C12-C13 1294 acétate de bornyle

Figure IV-3. Cycle de chromatographie en phase gazeuse (détection à ionisation de flamme ; FID) couplée à la détection électroantennographique EAD des composés volatils de melon jeune découpé utilisant des femelles de Bactrocera cucurbitae.

L’extraction des composés volatils a été réalisée par SPME (DVB-Carboxen-PDMS).

Tableau IV-2. Tentative d’identification des zones des chromatogrammes FID du melon jeune élicitant une réponse électroantennographique des femelles de Bactrocera cucurbitae par comparaison des IR-FID et IR-CG et des spectres de masse.

Bactrocera cucurbitae vers leurs fruits-hôtes I.2.3 Pipangaille lisse

Pour la pipangaille lisse au stade intermédiaire de maturité, treize zones sur le signal FID élicitant une réponse électroantennographique ont été repérées (Figure IV-4). La comparaison des indices de rétention et des spectres de masse permet de proposer une tentative d’identification pour chacune de ces zones, dans le tableau IV-3.

n° pic Position entre alcanes IR-CG Tentative d’identification

1 C10-C11 980 984 990 oct-1-én-3-ol β-pinène myrcène 2 C10-C11 ¹⁰³⁰ 1036 ρ-cymène limonène 3 C10-C11 1062 γ -terpinène 4 C10-C11 1100 non identifié 5 C11-C12 ^{1101 (6Z)-non-6-énal} 1103 nonanal 6 C11-C12 1121 non identifié 7 C11-C12 ¹¹⁵⁴ 1154 (2E,6Z)-nona-2,6-diénal (3Z)-non-3-én-1ol 8 C11-C12 1161 (2E)-non-2-énal 9 C11-C12 ¹¹⁷⁰ 1170 nonanol (6Z)-non-6-én-1-ol 10 C12-C13 1206 non identifié 11 C12-C13 1260 non identifié 12 C12-C13 1291 (2Z)-tridéc-2-ène 13 C13-C14 1355 non identifié

Figure IV-3. Cycle de chromatographie en phase gazeuse (détection à ionisation de flamme ; FID) couplée à la détection électroantennographique EAD des composés volatils de la pipangaille lisse de stade intermédiaire découpée utilisant des femelles de Bactrocera cucurbitae.

L’extraction des composés volatils a été réalisée par SPME (DVB-Carboxen-PDMS).

Tableau IV-3. Tentative d’identification des zones chromatogrammes FID de la pipangaille lisse de stade intermédiaire élicitant une réponse électroantennographique des femelles de Bactrocera

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