Analyse chromatographique

Les analyses par CG-SM des composés volatils ont été réalisées par un chromatographe Agilent Technologies 5973N et équipé d’une colonne capillaire apolaire SPB-5. Les conditions d’analyse des composés volatils extraits par SPME, sont présentées dans le tableau III-1.

Cloche en verre

Dispositif SPME Fruit

Coton

Figure III-2. Dispositif expérimental pour l’extraction par SPME des composés volatils émis par les fruits en conditions in situ.

Tableau IIII-1. Conditions d'analyse par CG-SM.

Chromatographe : Agilent Technologies 5973N

Colonne Phase stationnaire SPB-5 Longueur 60 m Diamètre interne 0,32 mm Épaisseur de film 0,25 µm Injecteur Mode splitless Température 250°C Four Température du four 230°C

Pas de programmation 4°C/min

Température finale 230°C

Gaz vecteur

Gaz Hélium

Débit de la colonne 0,7 mL/min

Spectromètre de masse : Agilent Technologies 5973N

Vide 37 mtorr

Source Impact

Courant d’ionisation 70°C

Température de la source 230°C

Mode de détection Scan

Gamme de masse 30 à 550 uma

Délai de solvant 0 minute

Parallèlement à ces analyses par CG-SM, les indices de rétention relatifs (IRR) propres à chacun des composés ont été calculés à partir d’une table de n-alcanes de C8 à C₂₂.

L’identification des composés a ensuite été réalisée par comparaison :

 Des spectres de masse expérimentaux à ceux de la littérature (Adams, 2007) de données informatisées NIST 02 et Wiley7n, et de standards injectés dans les mêmes conditions.

 Des IRR calculés à ceux de la littérature (Adams, 2007), de banques de données (NIST 02), et de standards injectés dans les mêmes conditions.

Pour chacun des fruits (jeunes et matures) et chacune des modalités d’extraction, trois fibres (trois répétitions) ont été utilisées simultanément dans les mêmes conditions, afin de vérifier

la répétabilité des résultats. Dans le cas de trop grandes différences entre les chromatogrammes obtenus, les mesures ont été renouvelées.

I.1.4 Analyse statistique

Les analyses statistiques et l’ensemble des figures de synthèse des résultats ont été réalisées à l’aide du logiciel R (version 2.15.0, R Development Core Team, 2012, Vienna, Austria). Pour les trois méthodes d’extraction (3 h à température ambiante, 3h à 37°C et 4h in situ), la visualisation des chromatogrammes de chaque fruit jeune et mature a révélé des répétitions très stables, avec des variations minimes des aires des pics des composés. Suite à ces comparaisons, le chromatogramme le mieux défini avec le minimum de bruit au niveau de la ligne de base, a été sélectionné.

Dans un premier temps, pour chaque fruit étudié, une analyse descriptive du profil-type d’émission a été réalisée en considérant l’ensemble des composés volatils émis et détectés dans l’espace de tête du dispositif de collecte. Cette analyse a pour objectif (i) de comparer les profils d’émission en composés volatils des fruits jeunes et matures afin d’identifier les changements s’opérant au cours de la maturation ; (ii) de caractériser l’influence des méthodes d’extraction sur ces profils d’émission.

Dans un deuxième temps, afin de comparer les fruits entre eux, selon leur profil d’émission en composés volatils pour une méthode d’extraction donnée, une sélection d’un nombre plus restreint de composés a été réalisée. Etant donné, le nombre important de composés identifiés dans l’ensemble des profils (281 composés), ce choix était nécessaire afin de simplifier le jeu de données. Seuls les composés identifiés appartenant à cinq familles chimiques ont été conservés (alcools, aldéhydes, esters, terpènes et composés aromatiques). Ces familles de composés ont été sélectionnées en raison de leur rôle reconnu dans les relations insecte-plante (Das et al., 2013). De plus, un deuxième criblage des données a été réalisé pour ne retenir parmi cette première sélection, que les composés émis dans au moins deux profils parmi les 54 étudiés. Sur ce jeu de données, constitué d’un nombre de composés volatils identifiés plus restreint, la variable considérée pour la suite des analyses est la présence ou l’absence de ces composés dans l’émission des différents fruits en considérant leur stade de maturité. Pour chaque méthode d’extraction, une Analyse en Composante Multiple (ACM) a été réalisée afin de caractériser les fruits du point de vue de l’ensemble des composés sélectionnés par la fonction MCA du package « FactoMineR » (Husson et al., 2010). L’ACM permet de

déterminer un sous-espace de dimension réduite, « compréhensible » par l’œil, sur lequel est projeté un nuage de variables. Pour obtenir un tel sous-espace, la méthode consiste à chercher, dans un premier temps, l’axe qui restitue la part la plus importante de l’inertie totale du nuage, autrement dit, de l’information qu’il contient. Dans un deuxième temps, une fois ce premier axe déterminé, il s’agit alors de chercher le second axe sur lequel le nuage se déforme le moins, tout en étant orthogonal au premier. Il suffira ensuite de réitérer le processus jusqu’à restituer l’intégralité de l’inertie du nuage. L’analyse des correspondances multiples permet de constituer de nouveaux axes factoriels sur lesquels sont projetés les variables.

Dans notre cas, cette ACM nous permet de récupérer les coordonnées des fruits sur un nombre d’axes factoriels choisi selon qu’ils restituent 95 % de l’inertie. Ces coordonnées sont utilisées comme base pour réaliser une Classification Ascendante Hiérarchique (CAH). Les objectifs de la classification sont donc de regrouper les fruits décrits par un ensemble de composés volatils, et d'interpréter ces regroupements. L'intérêt de regrouper les fruits est de les classer en conservant leur caractère multidimensionnel, et d’établir une typologie des classes de fruits constituées. La CAH est réalisée par la fonction agnes du package « Cluster » (Kaufman & Rousseeuw, 2009) considérant les distances euclidiennes calculées à partir des coordonnées des fruits sur les axes factoriels de l’ACM et par la méthode d’agrégation de « Ward ». C’est une méthode ascendante, partant d’un nombre de classes égal au nombre des individus et regroupant à chaque itération un (ou plusieurs) individus ou classes en fonction de la diminution de l’inertie inter-classes. Un dendrogramme issu de la méthode de CAH pour chaque méthode d’extraction aide à visualiser la hiérarchie des partitions obtenues. Le choix du niveau de coupure du dendrogramme c’est-à-dire du nombre de classes de la partition est facilitée par l’examen de l’histogramme des indices croissants de niveau. Chaque barre de cet histogramme indique la valeur d’une agrégation c’est-à-dire la perte d’inertie obtenue en passant d’une partition en s classes à la partition en s-1 classes. La coupure se fait au un niveau pour lequel l’histogramme marque un palier important, cette coupure est ensuite représentée sur le dendrogramme. Chaque classe est ensuite caractérisée par la présence ou l’absence de composés volatils selon leur poids dans la constitution de la classe.

I.2 Résultats