Mesure des spectres de uctuations

Nous avons vu dans la section 6.2.2 que l'illumination des vésicules contenant de la BR par de la lumière actinique pouvait induire des écarts entre les spectres de uctua-tions actifs et passifs. Ces eets allaient, parfois dans le sens d'une amplication des uctuations, et dans d'autres cas vers une diminution de celles-ci. Jacques Pécréaux avait interprété ces eets comme une compétition entre l'eet hors-équilibre, et celui du potentiel transmembranaire (section 6.2.2). Cependant, il est aussi possible que ces écarts ne soient que des artefacts dus à une mesure non reproductible des spectres.

6.3. Nos mesures de spectres de uctuations suivant le protocole de reconstitution de Jacques Pécréaux 131 Pour éclaircir ce point, nous avons entrepris de mesurer systématiquement trois séries de détection de contours successives (de 5000 contours chacune) pour chaque condition d'illumination. Les trois premières détections se faisant dans des conditions d'illumination rouge, elles représentent l'état d'équilibre du système. Les spectres issus de ces détections devraient donc se superposer. Nous avons donc pris comme critère de reproductibilité la superposition de ces trois premiers spectres, et nous ne considérons pour nos analyses que les séries d'expériences qui satisfont ce critère.

Nous avons remarqué que des détections des contours qui semblaient correctes "à l'÷il", ne donnaient pas forcément des résultats reproductibles. La gure 6.2 représente quatre spectres acquis, sur une même vésicule, en illumination rouge. Deux spectres ont été acquis successivement (ronds) puis, après une période d'illumination en jaune, deux autres spectres ont été enregistrés à la suite (carrés). On voit clairement que les deux premiers spectres, bien que pris successivement et à priori dans les mêmes conditions, ne se superposent pas, et de même pour les deux suivants. Ces grandes variations sont dues, non pas à des changements des propriétés de la membrane, mais probablement à la méthode de détection qui est très sensibles à certains paramètres diciles à contrôler, comme la mise au point précise de l'image de la vésicule.

Fig. 6.2. Spectres de uctuations acquis, dans des conditions d'illumination non-actinique (rouge), sur une vésicule contenant la BR, et préparée selon le protocole de reconstitution en détergent. Les spectres représentés par des ronds (creux et pleins) ont été acquis avant toute illumination active (jaune), et sont successifs. Les spectres re-présenté par des carrés (creux et pleins) ont été acquis après une période d'illumination active (jaune), et sont aussi successifs.

132 Chapitre 6. Spectroscopie de uctuations de vésicules géantes actives

spectres acquis en lumière non-actinique ne se superposent pas, car on ne peut plus conclure sur l'eet de l'activité. La diculté de ces mesures est de distinguer les vrais eets hors équilibres des artefacts de la détection.

Dans le but de vérier l'existence des eets hors-équilibre, et du potentiel trans-membranaire, nous avons eectué des détections de contours en alternant les condi-tions d'illumination rouge (passif) et jaune (actif), au moins deux fois. Pour s'assurer de la reproductibilité de la détection, nous avons acquis trois spectres successifs (de 5000 contours) dans chaque condition d'illumination. La durée d'une détection de 5000 spectres était de l'ordre de 5 minutes. La détection peut être perturbée par la présence d'autres vésicules, ou d'autres objets en suspension passant à proximité. Dans ce cas, les contours ne sont retenus que s'ils ne sont perturbés que pour de courtes durées (dizaines de secondes). Pour des perturbations de plus longue durée, nous avons soit refait la détection lorsque la vésicule s'éloignait de nouveau de l'élément perturbateur, soit abandonné dans les cas contraires. Du fait de ces aléas, tous les spectres d'une même série de mesures ne sont pas forcément exploitables. Nous ne considérons dans nos analyses que les séries où on avait au moins deux spectres passifs successifs, et deux spectres actifs successifs.

Eet de l'activité protéique

Avec la méthode de reconstitution de la BR décrite ci-dessus, quand on ne considère que les séries de détections où les trois premiers spectres passifs sont superposables, les spectres suivants (actifs et passifs) viennent aussi se superposer aux trois premiers. Comme on peut le voir dans les gures 6.3, il n'y a pas de diérences entre les spectres actifs et passifs, notamment dans la région des grands vecteurs d'onde où l'on s'attend à voir une amplication signicative des uctuations. On ne voit donc aucun eet dû à l'activité protéique sur les spectres de uctuations, ce qui est très surprenant.

Par ailleurs, la quantication des propriétés de ces membranes par la procédure de t prenant en compte le temps d'intégration τ = 33 ms n'a pas été concluante. En eet la procédure de t ne pouvait pas décrire correctement les courbes expérimentales, et donnait dans un grand nombre de cas un message d'erreur, tant pour les courbes actives que pour passives. Ceci s'explique par la forme des spectres mesurés qui sont linéaires en échelle logarithmique (voir chapitre 5 gure 5.13 p. 117). La fonction de t, qui n'est pas linéaire dans cette gamme de vecteurs d'onde en échelle logarithmique, ne permet pas de décrire ces spectres. Ceci pourrait être relié, comme nous l'avons vu dans le chapitre 5, à l'eet de la pesanteur qui déforme les grandes vésicules et perturbe le spectre de uctuations. En eet, les vésicules sur lesquelles la détection de contours avait donné des résultats probants avaient un diamètre compris entre 60 et 70 µm. Dans les cas où la procédure de t réussit pourtant à converger, elle donne des valeurs du module de courbure κ ≃ 10−19J nettement supérieures à la valeurs attendue pour ces membranes 4.10−20J [Manneville, 1999, Manneville et al., 2001], la présence de 5% en masse de

6.3. Nos mesures de spectres de uctuations suivant le protocole de reconstitution de Jacques Pécréaux 133 lipides PEG n'augmentant que faiblement cette valeur (+ 10−20J) [Cuvelier, 2005].

Conclusion : l'activité des protéines n'induit pas de diérences mesu-rables par détection de contours, au niveau de l'amplitude ou de la forme des spectres de uctuations.

Fig. 6.3. Spectres de uctuations acquis sur une vésicule contenant la BR et préparée se-lon le protocole de reconstitution en détergent, en échelles semi-logarithmique (haut), et logarithmique (bas). Les courbes rouges (et symboles creux) correspondent à des spectres acquis successivement sous une illumination non-actinique (rouge). Les courbes vertes (et symboles pleins) correspondent à des spectres acquis successivement sous une illu-mination actinique (jaune).

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