Analyse spectres EPC-BR actifs avec azide de sodium

Spectre Tension σ (N/m) κ(J) BRJB36 R1 3, 4.10−7± 1.10−8 5, 4.10−20± 1, 4.10−20 R2 2, 8.10−7± 2.10−8 7, 1.10−20± 2, 0.10−20 R3 3, 3.10−7± 1.10−8 5, 3.10−20± 1, 0.10−20 J1 1, 2.10−7± 1.10−8 1, 5.10−19± 2, 1.10−20 J2 9, 8.10−8± 6.10−9 9, 2.10−20± 1, 0.10−20 J3 7, 3.10−8± 8.10−9 1, 4.10−19± 1, 7.10−20

Tab. C.7. Mesure de la tension et du module de courbure par t de spectres de uctua-tion par l'expression théorique du spectre passif tenant compte du temps d'intégrauctua-tion (section5.3.3 p. 106) pour une vésicule EPC-BR en présence d'azide de sodium (recons-titution par l'éther). Les spectres passifs sont notés R# et les spectres actifs J#.

C.4. Analyse spectres EPC-BR actifs avec azide de sodium. 187

Spectres Loi de puissance ν

BRJB36 BRJB40 R1 _{−2, 15 ± 0, 04} R1 _{−1, 18 ± 0, 03} R2 −2, 14 ± 0, 04 R2 −1, 59 ± 0, 03 R3 _{−2, 17 ± 0, 05} J1 _{−1, 65 ± 0, 02} J1 _{−2, 70 ± 0, 04} J2 _{−1, 73 ± 0, 03} J2 −2, 78 ± 0, 06 BRJB38 J3 −2, 87 ± 0, 07 R1 −1, 53 ± 0, 08 BRJB33 R2 _{−1, 33 ± 0, 04} R1 _{−1, 86 ± 0, 02} J1 _{−1, 72 ± 0, 07} R2 _{−1, 50 ± 0, 03} J2 _{−1, 75 ± 0, 03} R3 _{−1, 67 ± 0, 03} R3 _{−1, 48 ± 0, 03} J3 −2, 08 ± 0, 03 J3 −1, 65 ± 0, 09 BRJB31 J4 −1, 88 ± 0, 02 R2 _{−1, 52 ± 0, 03} J1 −1, 69 ± 0, 03 J2 _{−1, 83 ± 0, 03}

Tab. C.8. Exposant de la loi de puissance apparente des spectres de uctuations de vé-sicules EPC-BR en présence d'azide de sodium (reconstitution par l'éther). Les spectres passifs sont notés R# et les spectres actifs J#.

188 Annexe C. Données additionnelles. Spectre Tension σ (N/m) q2 c (m−2) κ BRJB36 R1 3, 9.10−7± 3.10−8 6, 8.1011± 1, 1.1011 5, 6−19± 1, 4−19 R2 2, 4.10−7± 3.10−8 4, 0.1011± 8.1010 6, 0−19± 2, 1−19 R3 3, 7.10−7± 2.10−8 6, 8.1011± 8.1010 5, 5−19± 1, 0−19 J1 5, 3.10−8± 2.10−8 1, 1.1011± 4.1010 4, 8−19± 3, 8−19 J2 6, 4.10−8± 4.10−9 2, 4.1011± 2.1010 2, 7−19± 5−20 J3 3, 0.10−8± 9.10−9 8, 2.1010± 3.1010 3, 6−19± 2, 8−19 BRJB33 R2 5, 8.10−7± 9.10−9 2, 4.1012± 2.1011 2, 4−19± 2−20 J1 3, 5.10−7± 7.10−9 1, 4.1012± 1.1011 2, 5−19± 2−20 J2 3, 6.10−7± 1.10−8 9, 9.1011± 10.1010 3, 7−19± 5−20 BRJB33 R1 3, 2.10−7± 7.10−9 6, 2.1011± 4.1010 5, 1−19± 5−20 R2 2, 5.10−7± 7.10−9 1, 3.1012± 1.1011 1, 9−19± 3−20 R3 2, 7.10−7± 4.10−9 9, 1.1011± 5.1010 2, 9−19± 20−20 J3 1, 1.10−7± 2.10−9 2, 7.1011± 1.1010 4, 2−19± 3−20 BRJB38 R1 7, 6.10−7± 3.10−8 5, 2.1013± 2.1013 1, 4−20± 8−21 R2 9, 4.10−7± 2.10−8 2, 0.1013± 4.1012 4, 8−20± 1−20 J1 6, 6.10−7± 2.10−8 1, 9.1013± 6.1012 3, 5−20± 1−20 J2 2, 7.10−7± 1.10−8 1, 2.1012± 2.1011 2, 3−19± 5−20 R3 4, 7.10−7± 1.10−8 5, 8.1012± 9.1011 8, 2−20± 2−20 J3 4, 4.10−7± 2.10−8 9, 8.1014± 2.1015 4, 5−22± 8−22 J4 2, 6.10−7± 1.10−8 8, 9.1011± 9.1010 3, 0−19± 4−20 BRJB40 R1 3, 9.10−7± 1.10−8 1, 9.1012± 2.1011 2, 1−19± 4−20 R3 5, 8.10−7± 1.10−8 1, 6.1012± 1.1011 3, 6−19± 3−20 J1 3, 7.10−7± 7.10−9 1, 2.1012± 7.1010 3, 2−19± 8−20 J2 3, 4.10⁻⁷± 7.10⁻⁹ 9, 4.10¹¹± 6.10¹⁰ 3, 6⁻¹⁹± 10⁻²⁰

Tab. C.9. Mesure du vecteur de crossover, de la tension et du module de courbure en ttant par l'expression du spectre passif simple (équation 6.15 p. 151) pour des vésicules EPC-BR en présence d'azide de sodium (reconstitution par l'éther). Les spectres passifs sont notés R# et les spectres actifs J#.

ANNEXE D

Expérience de reectivité de rayons X.

Dans le cadre du réseau européen SoftComp, nous avons collaboré avec l'équipe de Tim Salditt, pour eectuer des mesures de réectivité de rayon X sur des structures mul-tilamellaires constituées de membranes "active" contenant la BR [Giahi et al., 2007]. Nous présenterons dans cette section, les prédictions de diérents modèles théoriques, sur l'eet de l'activité protéique sur des membranes connées, ainsi que le montage expérimentale utilisé, pour nir par exposer les résultats de ces expériences.

D.1 Principe de l'expérience.

Dans une structure multilamellaire, chaque membrane est connée par ses voisines. Nous avons vu dans le chapitre 3 qu'on peut modéliser le comportement des membranes dans un tel système en étudiant le cas plus simple d'une membrane uctuant à une distance d d'une paroi. La présence de cette paroi conne la membrane et empêche le développement de uctuations d'une amplitude supérieure à la distance les séparant. On a donc une réduction du nombre de conformations possibles, donc une diminution de l'entropie du système. Ceci donne naissance à une pression entropique répulsive entre la membrane et la paroi. Helfrich a dérivé l'expression de cette pression répulsive (que l'on appelle par conséquent pression de Helfrich [Helfrich, 1973b]) :

P (d) ∝ ^{(kBT )}

2

κd3 (D.1)

Si on revient au système multilamellaire, l'espacement entre les membranes est le résul-tat de l'équilibre entre les diérents types d'interaction (Van der Waals, électrosrésul-tatiques,

190 Annexe D. Expérience de reectivité de rayons X.

hydratation, ...etc). La pression répulsive de Helfrich, de portée supérieure aux forces de Van der Waals, participe de façon signicative à l'établissement de cette distance d'équilibre.

Dans un système multilamellaire actif, les uctuations sont ampliées par l'acti-vité des protéines. La pression de répulsion de Helfrich étant d'origine entropique, l'amplication des uctuations devrait augmenter la pression répulsive. On s'attend, intuitivement, à une augmentation de l'espacement entre membrane dans la structure multilamellaire.

Une analyse en loi d'échelle faite par [Prost et al., 1998], en se basant sur le modèle de canaux ioniques, montre que le connement augmente l'amplication des uctua-tions. Ils en déduisent que l'activité protéique induit une pression répulsive additionnelle qui s'écrit :

Pa(d) ∝ ^λpF

2 aρ

Dκd (D.2)

Cependant, le modèle de canaux ionique ne prend pas en compte le couplage à la courbure, et qui suppose l'existence d'une force nette liée à la perméation à travers les canaux (section 3.2.1 p. 54). [Sankararaman et al., 2002] ont utilisé le formalisme du modèle RTP, qui est plus adapté au cas des pompes. Ils trouvent que l'activité dans un milieu conné induit une augmentation de la tension, donc une diminution des uctuations, et de la pression répulsive. D'après ce modèle, l'espacement serait réduit par l'activation des protéines.

Fig. D.1. Schéma de la mesure de reéxion des rayons X sur une structure multilamel-laire de période d. [Giahi et al., 2007]

La mesure de la réectivité des rayons X est adaptée pour vérier ces prédictions, car elle permet de mesurer l'espacement entre membranes d dans une structure lamel-laire, sur une très grande gamme de longueurs (allant de 0,5 à 100 nm). En changeant

D.2. Protocoles. 191 l'angle d'incidence θ du faisceau, l'intensité rééchie présente des pics pour certaines inclinaisons, pour lesquelles les réexions sur les diérentes membranes sont cohérentes. Ces angles d'incidences particuliers sont donnés par la loi de Bragg :

2d sin θ = kλ (D.3)

Si on déni qz = ^{4π sin θ}_λ comme la diérence entre le vecteur d'onde de réexion, et celui d'incidence, la loi de Bragg devient qz = n2π

d. En mesurant les valeurs de qz

correspondantes au pics de Bragg, on a directement accès à la période du multilamellaire d.

D.2 Protocoles.

La structure multilamellaire est formé par le séchage d'une solution aqueuse, conte-nant des SUVs, sur un wafer de silicium de taille 10×15 mm2 ou 15×25 mm2. Le wafer est nettoyé par sonication dans un bain de méthanol, puis dans l'eau MQ. Ensuite il est traité avec une solution aqueuse de KOH pour le rendre hydrophile. Il est disposé sur un support parfaitement horizontal, et on dépose dessus 200 µl de solution de SUVs de la composition souhaitée, qu'on laisse sécher une nuit. Cette procédure permet d'avoir une structure multilamellaire bien alignée. Les SUVs utilisées pour préparer les multila-mellaires actifs ont été faites selon le même protocole de reconstitution que celui utilisé pour la pousse de GUVs (protocole A.2 p. 165).

Deux types de mesures de réectivité ont été conduites sur les structure multilamel-laires :

 Des mesures dans une chambre contenant un bain d'eau saturé en sel qui xe l'hu-midité. L'échantillon est hydraté par l'humidité de l'atmosphère de la chambre dont la température est contrôlée (40 − 42◦C). La source de rayons X correspond à la raie Cu Kα (E = 8, 048 keV ). Le signal rééchi a été mesuré par un détec-teur "fast scintillation counter" (Cyberstar, Oxford-Danfysik), avec un système d'atténuation automatisé.

 Des mesures sur des échantillons immergés dans une solution aqueuse. Dans ce cas, le faisceau de rayons X devant traverser 10 mm d'eau, il est nécessaire d'uti-liser une source de photons plus énergétiques (Mo Kα, E = 17, 48 keV ). Pour en assurer la stabilité dans un milieu aqueux, il est nécessaire d'appliquer une pres-sion osmotique sur le multilamellaire. Ceci est fait en solubilisant des polymères PEG de masse molaire 20000 g/mol. Une solution concentrée à 3,6 % en masse impose une pression osmotique de l'ordre de 104P a [Mennicke et al., 2006]. L'échantillon était activé par une source lumineuse halogène froide (KL1500, Schott), équipé de diérents ltres passe-bas (en fréquence) avec des longueurs d'onde de coupure de 600 nm pour la lumière rouge, et 500 nm pour la lumière jaune. Elle est positionnée à une distance de 20 cm de l'échantillon.

192 Annexe D. Expérience de reectivité de rayons X.