Matières lipidiques

L’approche expérimentale de cette partie, a touché différents volets de l’évaluation de l’activité lipolytique. L’objectif principal de notre travail est basé sur le suivi de l’évolution de la lipolyse au cours de l’affinage du fromage traditionnel Bouhezza.

L’estimation de la lipolyse au cours de la fabrication de six productions de Bouhezza (fabrications de 2012, 2013 et 2015), avec extraction de la matière grasse et détermination, par chromatographie en phase gazeuse (CPG), des acides gras libérés au cours de l’affinage. Chaque essai est répété deux à trois fois selon ce que préconise la méthode utilisée.

Les échantillons de fromage ont été prélevés de fabrications réalisées au niveau de la Wilaya d’Oum El Bouaghi. Neuf (9) échantillons prélevés de chacune de deux fabrications de 2012 (18 échantillons au total) ; de Oued Nenni, daïra d’Ain El-Beida (F7 et F8). D’autres échantillons issus de trois productions de 2013, deux à Ain Fakroun (F9 et F10) et l’autre d’Ain El-Beida (F11), ont été prélevés à raison 4 échantillons de chaque production à un intervalle de 15 jours (12 échantillons au total). La lipolyse a été suivie sur 2 fabrications réalisées l’une à Ain fakroun et l’autre à Ksar Sbihi en 2015 (F12 et F13), 5 échantillons par fabrication à 15, 30, 45,54 et 64 jours (10 au total). La détermination de la teneur en matière grasse a été réalisée au niveau de l’usine SAFILAIT selon la méthode acido-butyrométrique de Van Gulik (AFNOR, 1993).

Les lipides sont insolubles dans l’eau et très solubles dans les solvants organiques, tel l’éther éthylique. La plupart des méthodes de dosage des lipides exploitent ces propriétés physiques pour

48 extraire les lipides des aliments dans le but de mesurer leur concentration. Le dosage des lipides est réalisé selon deux méthodes : Folch et Soxhlet.

6.2.1. Extraction par la méthode de Folch

L’extraction des lipides, est réalisée suivant le protocole décrit par Folch et al. (1957). Elle est basée sur leur solubilité dans les solvants organiques. Pour la méthode de Folch, le méthanol et le chloroforme sont utilisés.

Les étapes de l’extraction des lipides selon la méthode de Folch sont indiquées dans la Figure 3. La méthode se base sur l’utilisation de solvants organiques pour extraire la totalité des lipides polaires et apolaires. A un échantillon de 50 g de fromage, 200 mL de chloroforme et 100 mL de méthanol sont ajoutés puis homogénéisés vigoureusement à l’aide d’un mixeur pendant 2 min. Par manque de solvant, nous avons procédé comme suit : un échantillon de 20 g de fromage est mélangé à 40 mL de méthanol et agité pendant 30 minutes. Puis, 80 mL de chloroforme sont ajoutés. Le mélange est de nouveau laissé sous agitation magnétique pendant 30 minutes puis filtré sur Büchner muni d’un papier filtre Whatman n°1. Le résidu est redispersé dans un mélange chloroforme/méthanol (2/1, v/v, 300 mL), homogénéisé pendant 3 min et filtré à nouveau. Les solides restants sont lavés avec un mélange chloroforme/méthanol (2/1, v/v, 60 mL).

Tous les filtrats sont rassemblés dans une ampoule à décanter. Les filtrats sont ajoutés à 0,2 volume d’une solution de NaCl à 0,7% du volume du filtrat. On observe une séparation en deux phases : une 1ère phase en surnageant contenant la quasi-totalité des lipides. Une 2ème phase organique est récupérée dans un ballon, puis le solvant est éliminé à 50°C à l’évaporateur rotatif sous vide (Serhan, 2008).

Les lipides issus de l’extraction selon la méthode de Folch sont récupérés. Ils sont alors conservés au froid à 4°C dans des tubes propres et couverts à l’aide de papier aluminium pour les protéger contre toute dégradation par la lumière ou rayons solaire.

6.2.2. Extraction par la méthode du Soxhlet

La méthode Soxhlet est la méthode de référence utilisée pour la détermination de la matière grasse dans les aliments solides déshydratés. C’est une méthode gravimétrique, puisqu’on pèse l’échantillon au début et la matière grasse à la fin de l’extraction.

On entend par teneur en matière grasse totale (MGT %) du lait sec, le % en masse de substance déterminée par pesée après une extraction à l'hexane ou à l’éther de pétrole comme solvant chaud, par le SOXHLET.

49 L’échantillon solide est pesé et placé dans une capsule de cellulose qui est perméable au solvant et à la matière grasse qui y est dissoute. L’extraction en continu par de l’éther éthylique et/ou éther de pétrole à point d’ébullition (P.E) 35°C qui dissout graduellement la matière grasse.

Le solvant contenant la matière grasse retourne dans le ballon par déversements successifs causés par un effet de siphon dans le coude latéral. La matière grasse s’accumule dans le ballon jusqu’à ce que l’extraction soit complète. Une fois terminée, l’éther est évaporé, sur un évaporateur rotatif, et la matière grasse est pesée.

L’expression de la teneur de la matière grasse en lipides est comme suit : % lipides = M (lipides) x 100

M (échantillon)

Avec précision, 5 g de fromage Bouhezza sont pesés en notant le poids exact dans la cartouche qui suffira pour l'extraction et la placer dans le SOXHLET en l'ayant recouvert avec du coton sec. Le ballon qui servira à recouvrir le solvant est pesé, quelques billes en verre y sont introduites et 200 mL d’hexane et/ou d’éther de pétrole. Après montage de l'apparei1, le réfrigérant est branché à un robinet d’eau courante. La température du chauffe-ballon, est alors réglée à 65°C (éviter les surchauffes). On effectue 4-6 siphonages au cours de l’extraction. Une fois la durée d’extraction est terminée, la majeure partie du solvant est chassée à l'aide du ROTAVAPOR pour éviter l'ébullition de matière grasse, qui pourrait modifier les indices d'acidité.

40 mL de méthanol 80 mL de chloroforme

0,2 volume d’une solution de NaCl à 0,7% du volume du filtrat

50 Le ballon contenant les lipides est placé à l'étuve pendant 30 min à 103°C, puis au dessiccateur pendant 30 min. On réalise une série de pesées jusqu'à l'obtention d'un poids constant. Les lipides sont récupérés et conservés au froid à 4°C dans des tubes propres en les couvrant à l’aide de papier aluminium pour leur protection contre toute dégradation, pendant 12 heures (Salghi, sans date).

6.2.3. Evaluation quantitative de la lipolyse

o Acides gras libres (AGL) : Pesée dans un Erlenmeyer de 250 mL, 1g (ou 0,25 g) de matière grasse dans 100 mL d’éthanol additionnés de 2 ml de phénolphtaléine. Après une bonne agitation, le tout est titré avec une base (0,1 N NaOH) en agitant vigoureusement jusqu'à ce que la neutralisation soit atteinte. Ceci est indiqué par une couleur légèrement rose qui persiste pendant 30s, le volume titrant utilisé est noté. Ces étapes sont répétées 3 fois.

Le calcul de la valeur des acides gras libre (AGL) de chaque échantillon est réalisé comme suit : % AGL =VxNx282 x100

W

% AGL : % d’acide gras libre (g/100g), exprimée en acide oléique (masse molaire : 282 g/mol). V : Volume du NaOH titrant (mL)

N : Normalité du NaOH titrant (mol/1000 mL) 282 : Masse molaire de l’acide oléique (g /mol) W : Masse de l’échantillon (g)

o Indice d'acide

L'indice d'acide correspond au nombre de milligrammes de KOH nécessaires pour neutraliser l'acidité libre d'un gramme de matière grasse (AOAC, 1997). Il donne une évaluation de la quantité en acides gras libres. Environ exactement 500 mg de matière grasse sont dissous dans un mélange éthanol/éther diéthylique (1/1, v/v) préalablement neutralisé par l'hydroxyde de potassium 0,1 N en présence de 4 à 5 gouttes de phénophtaléine. Titration sous agitation magnétique avec une du KOH 0,1 N jusqu'à coloration rose. L'indice d'acide se détermine comme suit :

IA (mg KOH. g-1 de matière grasse) = V x N x 56,1 / masse de la matière grasse

-V est le volume de KOH nécessaire à la neutralisation des acides gras libres

- N est la normalité de la solution de KOH ; -56,1 est la masse molaire de KOH.

Dans l’industrie des huiles et corps gras, l'acidité est couramment exprimée en pourcentage d'acide oléique (masse molaire : 282 g/mol). Cette expression, toutefois est superflue en chimie du lait où l’on peut se contenter de la simple correspondance entre la quantité de KOH et la masse de matière grasse (Serhan, 2008).

51 6.2.4. Dosage des Acides Gras Libres (AGL) par CPG dans Bouhezza de chèvre

Cette partie consiste en la détermination de la fraction lipidique et de sa composition en acides gras libres dans deux échantillons ; non épicé âgé d’un mois et épicé, âgé entre 50 et 72 jours d’affinage de 3 fabrications (F1, F4 et F7) de Bouhezza au lait de chèvre. Entre 10 et 15 g de fromage sont pesés dans du papier wattman N°1 et mis dans le Soxhlet, auxquels sont ajoutés environ 100mL d’éther de pétrole dans un ballon taré et maintenus sur un chauffe ballon pendant au moins 6 heures (Temps nécessaire pour l’extraction totale de la matière grasse).

Après extraction, le ballon contenant la MG passe au RotaVapor jusqu’à ce que le solvant ait disparu et il est mis à l’étuve pour compléter l’évaporation du solvant. On pèse le ballon avec la MG jusqu’à poids constant. La matière grasse est obtenue par différence entre le poids après extraction et le poids du ballon vide. Pour récupérer la MG en vue de l’analyse par CPG, une petite quantité (2mL) d’éther de pétrole est ajoutée dans le ballon pour rincer les parois de celui-ci et ainsi récupérer la MG dans des tubes à hémolyse propre et stérile. Ces derniers sont fermés à l’aide de parafilm et couverts pour éviter toute oxydation et seront destinés à l’analyse par CPG dans les 12 h. La méthylation des échantillons de MG a été réalisée par ajout de 200μL de matière grasse avec 750μL d’hexane et 200 μL d’une solution de KOH (2N dans le méthanol). Agitation au vortex pendant 2 min. Centrifugation à 5000 tours pendant 5 min puis récupération de la phase supérieure (phase grasse). Élimination des traces d’eau par double passage de l’échantillon dans une colonne remplie du Na3SO4.

L’appareil utilisé est un CPG, GC-17A (marque Agilent, USA) équipé d'un injecteur (Température de l’injecteur : 270°C) sur colonne et d'un détecteur d'ionisation de flamme (FID) (Température du détecteur : 280°C). La longueur de la colonne est 50 m ; diamètre 0,25 µm, épaisseur du film 0,2 µm (Ohio Valley Specialty Chemical Inc., Marietta, OH, USA). La température du Four : 179°C avec un débit de gaz vecteur de 0.9 mL / min. Le volume d’échantillon injecté dans le CPG est de 5μL. Le protocole adopté est celui utilisé par Mallatou et al. (2003), où les conditions de travail sont, la température du four de la colonne était programmée à partir de 60°C à 70°C à un taux de 1°C / min, après 2 min maintenir à 60 °C ; puis à 220°C à un taux de 10°C / min avec un maintien de 40 min à 220°C. La température du FID était fixée à 280°C.