Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence SDS (SDS-PAGE)

L’électrophorèse des protéines a pour but de séparer des molécules chargées à travers un gel sous l’effet d’un champ électrique. La technique et les étapes de la séparation des protéines par SDS PAGE seront décrites dans le chapitre 6.1.3.1.

Microorganismes

recherchés ^{Milieu de culture Dilutions utilisées}

Volume et mode d’ensemencement ^Incubation Streptocoques lactiques ^{M 17} 10-5-10-7(lait, Lben) 10-6- 10-8(fromage) ^{0,1mL en surface 37°C/ 48h} Lactobacilles MRS (Man, Rogosa et Sharp) ¹⁰

-5-10-7(lait, Lben)

10-6- 10-8(fromage) ^{1mL en masse 37°C/ 48h} FTAM ^{PCA (Plate Count Agar,}

MERCK, Germany) 10-5-10-7(lait, Lben) 10-6 à 10-8(fromage) ^{1mL en masse 30°C/ 72h.} Coliformes Totaux (CT) BLBVB (Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant) (Institut Pasteur)

Désoxycholate à 0,1% (DCL BIO RAD, France

10-1,10-2,10-3 Inoculation 1mL dans la masse 37°C / 24 to 48 h. Coliformes Fécaux (CF) BLBVB et EPEI (Eau peptone exempte d’indole (Institut Pasteur)

Désoxycholate à 0,1% (DCL BIO RAD, France)

10-1,10-2,10-3 0,5mL dans le liquide 44°C / 24h Streptocoques

Fécaux

Rothe (BIO-RAD, France)

Litsky (BIO-RAD, France) ^{SM, 10}

-1,10-2 1mL dans le liquide 0,5mL dans le liquide

37°C / 24 à 48h. 37°C / 48h Clostridium

Sulfito-réducteurs ^{Viande-Foie (Institut Pasteur) Solution mère}

5mL en anaérobiose en

masse ^{37°C / 24 à 72 h}

Flore halotolérante

hypersalé de Chapman (Mannitol Salt agar, Institut Pasteur)

10-3, 10-4-10⁻5 0, l mL en surface 37°C / 24 Levures et

Moisissures

OGA (Oxytétracycline Glucose Agar, Institut Pasteur)

10-3, 10-4-10⁻5 0,1mL en surface ^{20 - 25°C/5} jours

Salmonella

Bouillon Selenite de Na Hecktoen; Gélose Salmonella (S-S) (Institut Pasteur)

Solution mère ^{Inoculation 25 mL} en stries espacées de 5mm 37°C / 24-48 h. 37°C / 24 h Staphylococcus aureus Giolitti-Cantoni (Conda, Spain)

Chapman (Institut Pasteur) Baird Parker (Merck, Germany)

10-2, 10-3 et 10-4 Inoculation d’1mL 0,1mL en surface

37°C / 24h à 48h 37°C / 24h à 48h

Brucella ^{Gélose Columbia}

(BioMérieux) ¹⁰

40 5.2.3. Identification génétique et moléculaire des LAB par PCR-TTGE (PCR- Temporal Temperature Gel Electrophoresis) et séquençage de l’ADNr16S des isolats protéolytiques La technique d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide sous gradient de température dénaturant, est basée sur l'extraction directe de l'ADN microbien de la matrice du fromage (ou d’autres échantillons), et l'amplification de l’ADNr (codant l'ARN ribosomique 16S) à l’aide des amorces universelles. La TTGE est une méthode électrophorétique capable de détecter des différences entre les fragments d'ADN de même taille mais avec différentes séquences (Parayre et al., 2007). Les fragments peuvent être séparés sur un gel de polyacrylamide par un gradient de dénaturation basé sur le profil différentiel de dénaturation des fragments d’ADN amplifié (Ercolini, 2008).

5.2.2.1. Mode d’extraction de l’ADN génomique bactérien à partir de la masse fromagère L’ADN chromosomique a été extrait de la matrice du fromage Bouhezza, selon le protocole proposé par Licitra et al. (2007). Les étapes sont présentées en annexe 2.

5.2.2.2. Amplification de l’ADN extrait par PCR

L’Amplification selon le protocole proposé par Parayre et al, (2007), de la région du gène V3 de l’ADN codant l’ARN ribosomique 16S (ADNr 16S), par PCR utilise des amorces universelles V3P3-GC- Clamp (5′-GCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTC GGGAGGCAGCAG-3′) et V3P2 (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′) (Sigma, Italie). Ces amorces donnent des produits de PCR d’environ 233 paires de base. Le mélange réactionnel des amorces est composé de 50µL dans chaque tube de PCR composé de 40 µL de Mix PCR (Tableau 5, annexe 2) et 10µL de l’extrait de l’ADN bactérien obtenu de la matrice du fromage.

Le Thermocycleur, icycler Therman cycler (Laboratories-BioRad, Hercule, CA) permet d’amplifier les échantillons par une incubation à 94 °C/2min, suivie de 35cycles. Un cycle est la succession de 3 étapes : 30 s de dénaturation à 95 °C, 60 s hybridation à 63 °C et élongation 1 min à 72 °C, ensuite une extension finale de 5 min à 72 °C et à la fin de réaction stabilisation de la température à 4 °C.

Amplification, identification et séquençage du 16S rDNA

L'ADN génomique bactérien a été extrait des isolats de bactéries issues de Bouhezza, en utilisant Dneasy Blood & Tissue Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne) et utilisé comme modèle pour l'amplification du gène de l'ARN 16S. Les amorces universelles fD1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') et rD1 (5'-TAAGGAGGTGATCCAGGC-3') ont été utilisées (Weisburg et al., 1991). Des amplifications d'ADN ont été réalisées dans un modèle cyclique d'ADN (Techno, Barloworld scientific, Cambridge, UK). Tampon de PCR mixte (Tris-HCl 20 mM,

41 KCl 50 mM, pH 8,4), MgCl2 1,5 mM, 0,2 mM chacun de dNTP, 1 ADN polymerase Taq (Qiagen), 1 mM chaque amorce et 40 ng d'ADN. Un volume final de 50 μm. Les amplifications par PCR ont été réalisées dans les conditions suivantes : dénaturation à 94 °C pendant 5 min, 35 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 1 min, recuit d'amorces à 56 °C pendant 1,15 min, ADN à 72 °C pour 1,15 min.

Une extension finale a été ajoutée à 72 °C pendant 5 min. Les mélanges ont été analysés sur un gel d'agarose à 1% (p / v) avec du bromure d'éthidium (0,5 mg / ml) dans du tampon TAE (Tris-acétate 40 mM, EDTA 1 mM) pH 8,2-8,4 pendant 30 minutes à 100 V.

5.2.2.3. Electrophorèse sur gel d’agarose

Une séparation sur gel d’agarose permet de vérifier la pureté et la taille des produits de l’amplification. Le gel est préparé par l’addition de 1,5 g d’agarose à 100 mL de tampon Tris Borate EDTA (TBE 1X) (10,8 g/L de Tris-HCl, 0,93 g/L de l’EDTA, 5,5 g/L de l’acide borique, le pH est ajusté à 8,3).

Une fois le gel d’agarose coulé, on dépose 05 μL de l’amplifiât dans les puits de gel recouvert par le tampon Tris Borate EDTA (TBE 1X). La migration est réalisée sous une tension de 100V pendant 35 min dans une cuve de type Vary Gel (BIO-RAD). Comparaison des bandes obtenues à un marqueur de taille d’une échelle 100-pb (paire base) d’ADN (Fermentas Life Science, Vilnius, Lituanie).

La coloration est faite au bromure d’éthydium à 2,5 µg/L pendant 15 min suivie d’un rinçage pendant 5 min dans l’eau. Les gels sont scannés par transillumination à Ultraviolets avec photo.

5.2.2.4. Migration sur gel de polyacrylamide et analyses en TTGE

Les analyses en TTGE ont été réalisées avec le système universel de détection de mutation (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA, USA). Le gel utilisé est composé de 10% d’acrylamide, bisacrylamide (37,5 :1), et 7 M d’urée pour le gel de séparation ou Resolving, et de 8% d’acrylamide du gel de concentration ou Stacking. Le tableau 6 (annexe 2) présente la composition des deux gels utilisés.

Dix μL de l’amplifiât (produit de PCR) de chaque échantillon sont mélangés à 5 μL de tampon de charge (0,05% bleu de bromophenol, 0,05% xylène cyanol, et 70% glycérol). Le mélange de chaque échantillon est alors déposé dans un puit du gel de concentration. Le marqueur qui a été utilisé contient des amplifiâts de 12 souches (tableau 3 en annexe 2), et a été déposé à raison de 30 μL par puit (le marqueur est fourni par les laboratoires INRA-Agrocompus Rennes, France).

42 La migration est réalisée sur un gel de polyacrylamide à l’urée sous une tension de 41 V pendant 16h, avec un gradient de température de 63°C à 70°C variant de 0,4°C/h pour les bactéries à faible teneur en GC.

Une fois l’électrophorèse achevée, l’ADN est coloré par immersion du gel dans une solution de bromure d’éthydium (0,6µg de bromure d’éthydium par mL de tampon TAE 1,25X), pendant 15 min. Le gel est ensuite immergé dans l’eau distillée pendent 30 min. Les bandes sont enfin visualisées et photographiées par transillumination ultraviolette (E-Box 1000/26M, Euroclone, Siziano, Italie). Les bandes sont ensuite comparées avec les principaux micro-organismes détectés par profil de TTGE des espèces spécifiques ; les bandes sont analysées en utilisant un logiciel de comparaison de gels, à une base de données des espèces développée par Parayre et al. (2007), à l’aide du programme BioNumerics, version 4.6 (Applied Maths, Kortrijk, Belgique). Le tableau 3 (Annexe 2) regroupe les souches utilisées comme marqueurs pour la PCR –TTGE.

La base des données permet de comparer les bandes aux 56 espèces les plus fréquentes dans les fromages et les produits laitiers (tableau 4, Annexe 2), appartenant aux 18 genres (Arthrobacter,

Bacillus, Bifidobacterium, Brachybacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Enterobacterium, Kocuria, Microbacterium, Propionibacterium, Staphylococcus, Hafnia, Escherichia, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus).