Evaluation des critères de performance a) Définitions
Les critères de performance des techniques ont été déterminés sur la base des normes EN ISO 16140 et AFNOR XP V03-111.
L’inclusivité est la capacité d’une méthode à détecter la cible à partir d’un large éventail de souches de Pss. C’est une composante de la sensibilité qui est la capacité d’une méthode à donner un résultat positif quand la cible est présente.
La spécificité est la capacité de la méthode à donner un résultat négatif quand la cible n’est pas présente.
L’exactitude relative est le niveau de correspondance entre la réponse attendue (positive ou négative) et la réponse obtenue avec la méthode sur des échantillons identiques.
Le seuil de détection est le niveau de contamination le plus bas pouvant être détecté par la méthode.
La répétabilité quantifie l’homogénéité des résultats d’essai. C’est la capacité d’une méthode à donner le même résultat lorsque les deux échantillons identiques sont analysés dans les mêmes conditions.
Enfin, la reproductibilité est la capacité d’une méthode à reproduire toujours le même résultat lorsque deux échantillons identiques sont analysés dans des conditions différentes.
b) Modalités d’évaluation des critères de performance de la PCR, l’immunofluorescence et le test ELISA
L’évaluation de la sensibilité, de la spécificité, de la répétabilité et de l’exactitude a été réalisée au sein du LNPV pour les techniques d’immunofluorescence indirecte (sérum de marque Loewe), ELISA (kit de marque Agdia) et PCR (Coplin et al, 2002 – 4 couples d’amorces) sur 30 souches bactériennes de référence dont 15 souches de bactéries cibles (Pss) et 15 souches de bactéries non cibles (Tableau 1).
Les gammes de suspensions bactériennes suivantes ont été analysées : IF, 104 à 106 ufc/ml ; ELISA, 106 ufc/ml ; PCR, 108 ufc/ml. Chaque analyse a été répétée 3 fois (figure 1). La méthode d’isolement sur milieu King B ayant fait l’objet d’une étude préalable (Moreau, 2002), elle n’a pas été ré-évaluée dans le cadre de ce programme.
Figure 1 : schéma de détermination des critères de performance des techniques Figure 1: scheme for determining the performance criteria of the techniques
15 bact. cibles 15 non cibles suspensions bactériennes IF ELISA PCR x 3 répétitions
N° NOM PATHOGENE HOTE ORIGINE ANNEE
ISOLEMENT
1 CFBP 3171 Pantoea ananas pv. uredovora Puccinia graminis USA 1954
2 CFBP 1392 Pseudomonas syringae pv. syringae Syringae vulgaris UK 1950
3 CFBP 1719 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays USA
-4 CFBP 2502 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays var. Rugosa USA 1957
5 CFBP 3167 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays USA 1970
6 CFBP 3445 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays USA 1985
7 CFBP 3395 Pantoea stewartii subsp. stewartii - USA
-8 NCPPB 3253 Pantoea stewartii subsp. stewartii - -
-9 CFBP 3157 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays USA 1963
10 CFBP 3517 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays USA
-11 CFBP 3394 Pantoea stewartii subsp. stewartii Coléoptère USA 1954
12 CFBP 3166 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays USA 1975
13 CFBP 3845 Pantoea agglomerans - - 1956
14 CFBP 3396 Pantoea stewartii subsp. stewartii Coléoptère USA 1975
15 CFBP 3169 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays USA
-16 CFBP 1141 Pseudomonas viridiflava Phaseolus vulgaris Suisse 1927
17 CFBP 3168 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays USA 1957
18 CFBP 3393 Pantoea stewartii subsp. stewartii - -
-19 CFBP 3165 Pantoea stewartii subsp. stewartii Zea mays USA 1932
20 CFBP 4999 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis - -
-21 CFBP 1526 Erwinia carotovora subsp. atroseptica Solanum tuberosum UK 1957
22 CFBP 1731 Pseudomonas syringae pv. lapsa Zea sp. - 1731
23 CFBP 3456 Curtobacterium flacumfasciens pv. flacumfasciens Phaseolus vulgaris Hongrie 1957
24 CFBP 2046 Erwinia carotovora subsp. carotova Solanum tuberosum Danemark 1952
25 CFBP 2052 Erwinia chrisanthemi pv. zea Zea mays USA 1970
26 CFBP 5251 Xanthomonas campestris pv. campestris Brassicae oleracea gemmifera UK 1957
27 CFBP 3614 Pantoea stewartii subsp. indologenes Setaria italica Inde 1995
28 CFBP 2431 Pseudomonas corrugata - -
-29 CFBP 1232 Erwinia amylovora Pyrus communis UK 1959
30 CFBP 3521 Clavibacter michiganensis susp. nebraskensis
REF PATHOGENE
Le seuil de détection des 3 mêmes techniques a été évalué à partir d’une gamme de dilutions de 108 à 1 ufc/ml de la souche type Pss CFBP 3167 (figure 2). La concentration initiale a été vérifiée par dénombrement sur milieu King B. Cette analyse a été répétée 3 fois. Figure 2 : schéma de détermination des seuils de détection des techniques
Figure 2: scheme for determining the detection thresholds of the techniques
c) Test d’immunofluorescence (OEPP, 2006)
L’immunofluorescence a été réalisée avec l’antisérum polyclonal de lapin de marque Loewe (1/2000è) et l’anticorps anti-lapin conjugué à l’isothiocyanate de fluoresceine (Sigma 1/400). Les lames ont été observées au microscope à épifluorescence (grossissement x 1000). Les critères de reconnaissance de Pss sont d’une part, sa forme (bâtonnets qui peuvent être regroupés en paires avec des séparations caractéristiques de la division des cellules), sa
taille (0,9 à 2,0 µm de longueur et 0,4 à 0,7 µm de largeur) et la qualité de sa coloration
(fluorescence intense et continue).
La souche analysée est considérée comme négative lorsque aucune cellule à fluorescence vive et morphologiquement typique n’a été trouvée. A contrario, celle-ci est considérée
positive lorsqu’il y a présence de cellules à fluorescence vive et morphologiquement
caractéristiques.
d) Test ELISA (OEPP, 2006)
Le protocole DAS-ELISA est réalisé à l’aide d’un kit commercial de marque Agdia sur les suspensions bactériennes. Les microplaques ont ensuite été incubées à température ambiante pendant 2 heures et les densités optiques lues à une longueur d’onde de 405 nm. Un échantillon est déterminé comme positif lorsque la valeur moyenne des densités optiques est supérieure à un seuil supérieur à deux fois la moyenne des valeurs des densités optiques des témoins négatifs.
e) Test PCR (Coplin & al, 2002)
L’extraction de l’ADN bactérien a été réalisée par choc thermique : ébullition à 95°C pendant 10 minutes, puis congélation. La PCR a été réalisée avec 2 µl d’extrait d’ADN et 23 µl de mélange réactionnel comprenant 1U/µl de Taq polymerase (Promega), 0,50µM de chaque amorce, 0,20mM de dNTP dans 1,5mM de MgCl2 et 1x de tampon 10x.
Les couples d’amorces sont CPSL1 CCTGTCAGTCTCGAACC et CPSR2c
ATCTCGAACCGGTAACC (1100 pb) ; HRP1d GCACTCATTCCGACCAC et HRP3c GCGGCATACCTAACTCC (900 pb) ; ES16 GCGAACTTGGC-AGAGAT et ESIG2c GCGCTTGCGTGT-TATGAG (920 pb) ; ESIG 1 CGAAGC-GAGGACACACG et ESIG2c
X 3 répétitions Pantoea stewartii subsp. stewartii CFBP 3167 108 107 106 105 104 103 102 10 1 ufc/ml Immunofluorescence ELISA PCR
Les conditions de l’amplification de la PCR sont : 1 cycle d’une minute à 94°C, puis 25 cycles de 15 secondes à 94°C, 15 secondes à 55°C, 30 secon des à 72°C et enfin un cycle de 5 minutes à 72°C. Les amplifiats ont ensuite été sépa rés sur un gel d’agarose à 3% avec une migration de 1 V/cm et révélés dans une solution de Bromure d’Ethidium (BET).
f) Evaluation du pouvoir pathogène (OEPP, 2006)
Ce test d’identification a été effectué sur des variétés sensibles de plants de maïs avec 15 souches de Pss (2 répétitions). Les plants de maïs ont été inoculés dans la tige, 15 jours après le semis avec des suspensions bactériennes à 108 ufc/ml puis placés à une température de 26°C (+/- 1°C), une hygrométrie alla nt de 80 à 100 % et une photopériode de 14 heures par jour.
Les premiers symptômes sont apparus environ 5 jours après l’inoculation. Cependant, afin d’observer l’ensemble des lésions provoquées par chaque souche, la lecture a été effectuée 13 jours après l’inoculation, puis à 17 jours. Un prélèvement (4 à 5 cm de tige) a été effectué afin de confirmer les symptômes par un ré-isolement sur milieu King B et une immunofluorescence.
Premiers résultats
La PCR et l’immunofluorescence sont les deux techniques qui ont obtenu les meilleurs critères de performance (seuil de détection, sensibilité, spécificité, répétabilité et exactitude) sur souches pures.
Ces deux techniques ont donc été retenues pour la réalisation de l’essai inter-laboratoires qui vise à vérifier la validité des méthodes sur semences.
Préparation de l’organisation d’un essai inter-laboratoires
a) problématique : obtention de semences contaminées
Comme la bactérie Pantoea stewartii subsp. stewartii n'est pas présente en Europe, la recherche de lots de semences contaminées naturellement a été effectuée aux États-Unis. Malheureusement, il n’a pas été possible d'obtenir de tels lots de semences. La seule façon de travailler sur les différentes techniques de détection du Pss a été d'obtenir des échantillons contaminés artificiellement. Le but étant d’obtenir des semences avec différents niveaux de contamination. La contamination de ces semences se devait d’être homogène et stable dans le temps afin de pouvoir l’utiliser dans l’essai inter-laboratoires.
Les deux méthodes de contamination qui ont été testées sont l’injection dans la graine et l’infiltration sous vide.
b) Matériel et méthodes pour l’obtention de semences contaminées Les inoculations pour injection ont été réalisées avec des suspensions de la souche type Pss CFBP 3167 (concentrations de 108, 106 et 103 ufc/ml), de la souche Pantoea stewartii subsp.
indologenes CFBP 3614 (108 ufc/ml) et une bactérie saprophyte isolée de graines de maïs présentant une morphologie de colonie sur milieu King B proche du Pss (108 ufc/ml). L’inoculation a été réalisée avec 100 µl de suspension bactérienne injectés dans chaque graine préalablement imbibée. Après séchage à température ambiante, les graines ont été stockées à +4°C.
L’ ‘inoculation par infiltration sous vide a été réalisée seulement à partir de la souche type
Pss CFBP 3167 à une concentration de 106 ufc/ml. Les graines préalablement imbibées ont été mises en contact avec la suspension bactérienne sous une cloche à vide. Le vide a été
maintenu pendant 2 à 4 minutes sous agitation. Puis, les graines ont été égouttées, séchées à température ambiante et stockées à +4°C.
La vérification de la contamination des graines a été réalisée 3, 7 et 15 jours après
contamination par analyse avec dénombrement sur milieu King B et par
immunofluorescence.
c) Résultats des essais de contamination de semences
Les résultats des isolements sur milieu et des tests d’immunofluorescence ont montré que les semences n’avaient pas un niveau de contamination homogène et stable dans le temps. Dans le cadre de l’essai inter-laboratoires, le matériel à disposition des laboratoires participants se devant d’être homogène et stable, le choix a alors été fait de contaminer des macérats de semences de maïs et d’envoyer des extraits inactivés.
d) Réorientation : production de macérats contaminés
Les macérats ont été préparés à partir de 35g de graines de maïs dans 70 ml de tampon PBS stérile pendant une nuit à 4°C. Les contaminati ons ont été réalisées avec des suspensions bactériennes de souches de Pss et de non-Pss afin d’obtenir les concentrations finales de macérats suivantes : souche type CFBP 3167 à 108 ufc/ml, Pss CFBP 3169 à 106, 105,104 et 103 ufc/ml, souche Pantoea stewartii subsp. indologenes CFBP 3614 à 108 ufc/ml, souche de Pseudomonas corrugata LNPV 2.29 à 108 ufc/ml.
Après contamination, le protoocle OEPP a été suivi : une agitation à 200 tours/minute à température ambiante pendant 10 à 15 minutes, une concentration x10 des extraits a été réalisée par une centrifugation à 10000 g pendant 10 minutes. Ensuite, le culot a été resuspendu dans 2 ml de solution saline. Puis, l’inactivation a été effectuée par un bain à 70°C pendant 15 minutes. Des vérifications de conce ntration des inocula ont été effectuées par dénombrement de colonies sur milieu King B et par des tests d’immunofluorescence à chaque stade de la manipulation.
Les résultats des dénombrements sur milieu King B ont montré la mortalité des bactéries après l’inactivation. Ce procédé peut donc être utilisé pour les échantillons de l’essai inter-laboratoires.
Cependant, après l’inactivation, lors de la lecture du test d’immunofluorescence, les bactéries ont présenté des lésions avec une paroi abîmée voire cassée et un halo fluorescent autour des cellules bactériennes. La lecture a été, par conséquent, rendue difficile et inhabituelle. Les extraits inactivés ne sont donc pas adaptés à la lecture au microscope à épifluorescence. L’inactivation ne pouvait pas être utilisée dans le cadre d’un essai inter-laboratoires pour tester la technique d’immunofluorescence.
RESULTATS
Les résultats obtenus lors de la phase préparatoire d’évaluation des méthodes et lors de la phase de préparation des échantillons nécessaires à l’essai inter-laboratoires ont conduit le LNPV :
- à sélectionner les techniques IF et PCR pour l’essai ;
- à modifier le protocole d’essai
o au profit de macérats contaminés et non de semences contaminées ;
o la lecture des lames d’immunofluorescence étant rendue difficile par l’inactivation, le choix a été fait d’envoyer aux laboratoires participants des lames avec les extraits centrifugés mais non inactivés et fixés à l’éthanol à 96 % ; les extraits inactivés ont été conservés pour les tests à réaliser en PCR;
L’obtention des macérats a été réalisée de la façon suivante : les graines préalablement imbibées dans le volume de 70ml de PBS ont été agitées à 200 tours/minutes à température ambiante pendant 15 minutes ; les macérats ont été concentrés x10 par une centrifugation à 10 000 g pendant 10 minutes. Ensuite, le culot a été resuspendu dans 2 ml de solution saline. L’échantillon a ensuite été séparé en deux pour réaliser d’une part une inactivation à 70°C pendant 15 minutes pour la réalisation des PCR et d’autre part, la fixation à l’alcool 96% sur des lames pour immunofluorescence.
Les témoins négatifs préparés sont les suivants : une souche de Psi CFPB 3614, de Pc CFBP 2431 et deux bactéries saprophytes isolées de graines de maïs. De plus, un échantillon négatif a été préparé avec 35g de graines de maïs dans 70 ml de tampon PBS. Les témoins positifs (2 répétitions) utilisés sont dix extraits contaminés à différentes concentrations par du Pss (souches CFBP 3169, CFBP 3396 et CFBP 3167).
Des vérifications de concentration des inoculums ont été effectuées par dénombrement de colonies sur milieu King B et par des tests d’immunofluorescence.
Les laboratoires ont reçus 30 lames d’immunofluorescence avec trois concentrations des macérats (suspension mère, 1/10, 1/100) par 2 répétitions et 30 microtubes de PCR de 500 µl avec des suspensions mère inactivées.
Figure 3 : Schéma des lames d’immunofluorescence Figure 3 : Scheme of immunofluorescence slides
Les tests réalisés par les laboratoires sont la coloration et la lecture sous microscope à épifluorescence des lames d’immunofluorescence, les tests de PCR selon le protocole de Hufnagl (non publié) et la PCR temps réel selon le protocole de Tambong (2006).
Les résultats de l’EIL feront l’objet d’une synthèse une fois l’analyse des données terminée.
CONCLUSION
Ce travail de collaboration permettra d’optimiser le schéma de détection et d’identification du
Pantoea stewartii subsp. stewartii sur semences de maïs et de modifier le protocole OEPP.
Cependant, l’étape d’extraction de la bactérie à partir des semences n’aura pas pu être étudiée dans le cadre de ce programme. L’obtention de semences contaminées reste une limite à l’approfondissement de ces travaux.L’obtention des critères de performance des méthodes interviendra en appui aux décisions du Ministère chargé de l’Agriculture concernant les méthodes à utiliser dans la gestion du risque d’introduction du flétrissement bactérien du maïs en France.
REMERCIEMENTS
Le LNPV remercie les laboratoires JKI en Allemagne, AGES en Autriche, FERA en Grande-Bretagne et PPCRI en Turquie pour leur participation dans les travaux de ce programme EUPHRESCO.
BIBLIOGRAPHIE
SM 1/10 1/100
Rep 1
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AFPP – 9ème CONFÉRENCE INTERNATIONALE SUR LES MALADIES DES PLANTES TOURS – 8 ET 9 DÉCEMBRE 2009
MISE EN EVIDENCE DU PSTVD ET TCDVD EN FRANCE SUR PLANTES