Les études d’occurrence ont permis de montrer que les avoines et dans une moindre mesure les orges de printemps sont les céréales les plus touchées par les toxines T-2 et HT-2 (Edwards et al., 2009). Plusieurs études sont en cours pour déterminer les champignons producteurs de ces toxines. Fusarium langsethiae semble être le principal champignon à l’origine de la contamination dans les pays d’Europe du Nord (Torp and Niremberg, 2004 ; Parikka et al., 2008), mais il n’est peut-être pas le seul responsable car d’autres espèces telles que Fusarium poae ou Fusarium sporotrichioïdes ont également été identifiées (Causin et al., 2008). Beaucoup d’inconnues subsistent sur le pouvoir de compétition entre les différentes espèces pathogènes. Les recherches se concentrent aujourd’hui essentiellement sur Fusarium langsethiae afin de mieux comprendre la biologie du champignon, son mode de dissémination, le stade de contamination et l’impact du climat. Les travaux sont également en cours afin d’évaluer l’impact des pratiques agronomiques sur la qualité sanitaire des orges de printemps.
MATERIEL ET MÉTHODES
Depuis 2006, 451 parcelles d’orges, majoritairement d’orge de printemps, ont été enquêtées par ARVLIS - Institut du végétal en collaboration avec différents partenaires de la filière orge et principalement les organismes stockeurs.
CHOIX DES PARCELLES ENQUETEES
L’objectif de cette enquête pluriannuelle est d’identifier puis hiérarchiser l’importance des différents facteurs impliqués dans la contamination en toxines T-2 et HT-2 de l’orge.
Cette étude a été menée dans les principales régions françaises productrices d’orges : Bourgogne, Centre, Franche Comté, Poitou-Charentes, Champagne-Ardenne, Ile-de-France, Normandie, Nord Pas de Calais, Alsace et Lorraine.
La répartition annuelle des parcelles étudiées est de : 33 en 2006, 126 en 2007 et 293 en 2008.
Le premier objectif étant d’identifier les facteurs agronomiques susceptibles d’influer sur les teneurs en toxines T-2 et HT-2, la sélection des parcelles étudiées s’est basée sur la variabilité des critères agronomiques caractérisant l’historique de la parcelle et l’itinéraire cultural de l’orge.
QUESTIONNAIRE AGRONOMIQUE, PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS ET ANALYSE DES TRICHOTHECENES
Pour chaque parcelle, un questionnaire retraçant l’historique cultural a été renseigné, et un échantillon de 3 kg de grain a été constitué à la récolte. Cet échantillon est composé de 3 sous-échantillons de 1kg minimum chacun, prélevés à la vidange de la moissonneuse batteuse. Les trois sous-échantillons ont été rassemblés, homogénéisés, nettoyés pour retirer les impuretés (pailles glumes, petits grains, grains cassés, poussières…) puis divisés de manière à obtenir 1,5kg de grain pour analyse. Celui-ci est d’abord broyé à l’aide d’un broyeur équipé d’une grille de 1mm, puis un sous-échantillon de 500g de ce broyat été prélevé pour analyse des trichothécènes par chromatographie liquide, détection couplée masse-masse (LC-MSMS). Les teneurs en DON et en toxines T-2 et HT-2 sont donc disponibles pour l’ensemble de ces échantillons.
ANALYSE STATISTIQUE DES DONNEES
L’ensemble de l’étude statistique a été réalisée sur la somme des toxines T-2 et HT-2 sur laquelle porte le projet de réglementation.
Un modèle linéaire mixte a été utilisé pour analyser les données. La variable à expliquer, teneur en toxines T-2 et HT-2, a été transformée en ln(T-2+HT-2) afin de normaliser la distribution des données. Les variables explicatives sont qualitatives (facteurs agronomiques, année, région). Le facteur année a été considéré comme aléatoire, ainsi que toutes les interactions impliquant ce facteur.
RESULTATS
TENEURS EN DEOXYNIVALENOL ET TOXINES T-2 ET HT-2 MESUREES DANS LES ENQUETES
Niveaux de contamination en DON et en toxines T-2 et HT-2
Les niveaux de contamination rencontrés sur ces 3 années d’étude 2006 à 2008 sont relativement faibles. 96% des échantillons ont une teneur en DON inférieure à 500µg/kg, avec toutefois des dépassements ponctuels de la limite maximale réglementaire fixée à 1250µg/kg pour 1% des échantillons. Les teneurs en toxines T-2 et HT-2 sont également relativement faibles, avec 96% des échantillons en deçà de 100µg/kg pour la somme des deux toxines (Figure 1). La corrélation entre les 2 toxines est moyenne (R²=0.44) mais en tendance, il y a 3 fois plus de toxine HT-2 que de toxine T-2 (résultats non présentés).
Figure 1 : Fréquence de répartition des 451 échantillons analysés par classe de teneur en DON et toxines T-2+HT-2 (µg/kg)
Percentage frequency of DON and T-2+HT-2 toxins in the 451 samples (µg/kg)
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% F ré q u e n c e d 'é c h a n ti llo n s ( % ) <=100 100-250- 250-500- 500-750- 750-1000- 1000- 1250->1250 DON (µg/kg) 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% F ré q u e n ce d 'é ch a n ti llo n s (% ) <=10 10-25- 25-50 50-75- 75-100- 100-125- 125-150 >150 Toxines T-2 + HT-2 (µg/kg)
Opposition entre DON et toxines T-2 et HT-2
L’analyse globale des teneurs en trichothécènes mesurées montre une opposition entre les teneurs en DON d’une part, et les teneurs en toxines T-2+HT-2 d’autre part. Aucun échantillon n’est fortement contaminé simultanément par les 2 toxines (Figure 2).
Figure 2 : Opposition entre teneurs en DON et toxines T-2+HT-2 sur orges des 451 échantillons
T-2+HT-2 against DON concentration for 451 barley samples
0 50 100 150 200 250 300 350 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 DON (µg/kg) T o x in e s T 2 + H T 2 ( µ g /k g )
IMPACT DES FACTEURS PEDOCLIMATIQUES SUR LES TENEURS EN TOXINES T-2+HT-2
L’analyse de variance met évidence une interaction significative au seuil de 5% entre l’année et la région, qui explique 15% de la variabilité des teneurs en toxines T-2 + HT-2. Ce constat est classique puisque les conditions climatiques annuelles et régionales vont conditionner le développement des espèces de Fusarium , ainsi que la production de toxines associées.
IDENTIFICATION DES FACTEURS AGRONOMIQUES INFLUENÇANT LES TENEURS EN TOXINES T-2+HT-2
Les niveaux moyens de contamination en toxines T-2 et HT-2 sont relativement peu élevés, mais la variabilité des teneurs permet toutefois de réaliser une étude statistique pertinente. Les résultats présentés ci-dessous ne sont pas toujours très différents, néanmoins ils ont toujours une signification statistique.
Orges de printemps, orges d’hiver
L’analyse de variance montre une différence significative entre les orges d’hiver et les orges de printemps. La problématique T-2 et HT-2 concerne exclusivement les orges de printemps (Tableau 1), 4 fois plus contaminées que les orges d’hiver. Le test de Tukey confirme la différence entre les moyennes ajustées des orges d’hiver et des orges de printemps.
Tableau 1 : Teneur en toxines T-2 et HT-2 des orges d’hiver ou de printemps - Moyennes ajustées (435 données)
T-2+HT-2 concentration for winter or spring barley – Adjusted means (n=435) Toxines T-2 + HT-2 en µg/kg (Moyennes ajustées) Test de Tukey (5%) ORGE HIVER 6 a ORGE PRINTEMPS 22 b
Les moyennes suivies de la même lettre dans la colonne ne sont pas différentes entre elles d’après le test de Tukey significatif à 5%
Means in the same column, followed by the same letter are not significantly different, according to the Tukey test (5%)
Date de semis
L’analyse de variance met en évidence l’importance de la date de semis, que ce soit pour les orges d’hiver ou de printemps. Ce facteur explique 12% de la variabilité des teneurs en toxines T-2 et HT-2. Plus les parcelles sont semées tard, et plus elles sont contaminées (Tableau 2). Dans notre jeu de données, les semis d’automne concernent des orges d’hiver, mais également des orges de printemps. Dans le cas spécifique des orges de printemps, les semis d’automne restent les moins contaminés. Le test de Tukey confirme la différence entre les moyennes ajustées de chacune des catégories de semis.
Tableau 2 : Teneur en toxines T-2 et HT- des orges en fonction de la date de semis - Moyennes ajustées (427 données)
Effect of sowing time on T-2+HT-2 concentration in barley– Adjusted means (n=427) Toxines T-2 + HT-2 en µg/kg (Moyennes ajustées) Test de Tukey (5%) AUTOMNE 9 a HIVER 17 b PRINTEMPS 29 c
Les moyennes suivies de la même lettre dans la colonne ne sont pas différentes entre elles d’après le test de Tukey significatif à 5%
Means in the same column, followed by the same letter are not significantly different, according to the Tukey test (5%)
L’analyse de variance révèle l’impact du précédent cultural sur la culture d’orge qui suit. Ce facteur explique 9% de la variabilité des teneurs en toxines T-2 et HT-2. Les précédents céréales à paille induisent plus de toxines T-2 et HT-2. Le test de Tukey nous permet de classer les précédents en 2 groupes, les céréales à paille étant isolées des autres précédents. Les parcelles en précédent orge sont en tendance plus élevées mais elles ne sont pas significativement différentes des autres parcelles en précédent céréales à paille (Tableau 3). Tableau 3 : Teneur en toxines T-2 et HT-2 des orges en fonction du précédent - Moyennes
ajustées (434 données)
Effect of the previous crop on T-2+HT-2 concentration in barley– Adjusted means (n=434) Toxines T-2 + HT-2 en µg/kg (Moyennes ajustées) Test de Tukey (5%) AUTRE 10 a BETTERAVE 10 a MAÏS 11 a BLE 18 b ORGE 20 b
Les moyennes suivies de la même lettre dans la colonne ne sont pas différentes entre elles d’après le test de Tukey significatif à 5%
Means in the same column, followed by the same letter are not significantly different, according to the Tukey test (5%)
La connaissance de l’antéprécédent apporte également une petite part d’explication complémentaire au précédent dans la variation des teneurs en toxines T-2 et HT-2. La connaissance de ces deux informations cumulées explique 12% de la variabilité mais l’antéprécédent seul n’apporte pas d’information significative. Les parcelles sont d’autant plus contaminées qu’elles cumulent des céréales à paille. Le test de Tukey rejoint ce constat : il nous permet de classer les historiques parcellaires en 2 groupes, selon le précédent cultural (Tableau 4).
Tableau 4 : Teneur en toxines T-2 et HT-2 des orges en fonction du nombre de céréales à paille cultivées les 2 années précédant la culture d’orge- Moyennes ajustées (414 données)
Effect of the number of small grain cereals on the last 2 years on T-2+HT-2 concentration in barley– Adjusted means (n=414)
Toxines T-2 + HT-2 en µg/kg (Moyennes ajustées) Test de Tukey (5%) AUCUN 14 a 1- ANTEPRECEDENT 10 a 1- PRECEDENT 18 b 2 ANTEPRECEDENT ET PRECEDENT 22 b
Les moyennes suivies de la même lettre dans la colonne ne sont pas différentes entre elles d’après le test de Tukey significatif à 5%
Means in the same column, followed by the same letter are not significantly different, according to the Tukey test (5%)
L’analyse de variance montre que le travail du sol n’apporte pas d’explication significative sur les variations de teneurs en toxines T-2 et HT-2 (Tableau 5). Le travail du sol n’est donc pas un élément déterminant pour les toxines T-2 et HT-2 mais n’oublions pas que le labour joue un rôle important dans la maîtrise des teneurs en DON.
Tableau 5 : Teneur en toxines T-2 et HT-2 des orges selon le travail du sol - Moyennes ajustées (428 données)
Effect of tillage on T-2+HT-2 concentration in barley– Adjusted means (n=428) Toxines T-2 + HT-2 en µg/kg (Moyennes ajustées) Test de Tukey (5%) LABOUR 17 a NON LABOUR 19 a
Les moyennes suivies de la même lettre dans la colonne ne sont pas différentes entre elles
d’après le test de Tukey significatif à 5%
Means in the same column, followed by the same letter are not significantly different, according to the Tukey test (5%)
Sensibilité variétale et protection fongicide
L’analyse de variance montre que les 22 variétés du réseau d’enquête n’ont pas le même comportement vis-à-vis des variations de teneurs en toxines T-2 et HT-2. Cependant, cette démarche d’enquête ne permet pas d’étudier les variétés de façon pertinente. Des réseaux dédiés à l’évaluation des variétés sont préférables.
L’analyse de variance sur l’influence de la protection fongicide semble montrer qu’il ne s’agit pas d’un critère neutre. Mais là encore, cette démarche d’enquête ne permet pas d’étudier l’impact des protections fongicides. Des dispositifs spécifiques permettent sont plus adaptés.
DISCUSSION
Un lot d’orge brassicole commercialisé demain devra respecter les limites réglementaires à la fois pour le DON et pour les toxines T-2 et HT-2. Du fait de l’opposition entre ces deux toxines, il faudra s’assurer que les bonnes pratiques à mettre en place pour l’une ne favorisent pas l’autre. Cette opposition n’est pas surprenante puisque les Fusarium responsables sont différents. Celle-ci peut s’expliquer par la compétition entre les espèces, des optimums climatiques différents, ou encore une installation différée dans le temps. Beaucoup d’inconnues subsistent quant aux Fusarium responsables de la production des toxines T-2 et HT-2. Des programmes de recherche sont en cours et, comme évoqué précédemment, les recherches se concentrent essentiellement sur F. langsethiae afin de mieux comprendre la biologie du champignon, son mode de dissémination, le stade de contamination et l’impact du climat. Ainsi, le projet BARSAFE, financé par l’Agence Nationale de la Recherche et engagé en 2008 sur une durée de 3 ans, rassemble ARVALIS-Institut du végétal, l’INRA et le CNRS sous la coordination de l’ARVALIS-Institut Français de la Brasserie et de la Malterie (IFBM). Le but de ce projet est de mieux cerner et mieux gérer, par la mise en place de dispositifs expérimentaux, tous les aspects du risque sanitaire encouru lié à F. langsethiae tout au long de la filière, de la parcelle d’orge brassicole aux produits finis (suivi des différentes étapes de fabrication de la bière).
En France, les toxines T-2 et HT-2 semblent épargner les orges d’hiver (IFBM, 2008), en moyenne 4 fois moins contaminées que les orges de printemps dans notre étude. Les teneurs pour la somme des 2 toxines ne dépassent pas 32µg/kg sur orge d’hiver. Deux
hypothèses peuvent expliquer cette différence : soit une meilleure tolérance génétique des orges d’hiver, soit une interaction entre le stade de la céréale et la période de contamination du champignon responsable.
La date de semis est un élément déterminant : plus les orges sont semées tard et plus les niveaux de contamination sont élevés. Quel que soit le type d’orge, les semis d’automne sont 2 fois moins contaminées que dans les semis d’hiver et 3 fois moins que les semis de printemps. Ce constat est également fait dans la mise en place d’un essai variété mis en place à Ouzouer-le-Marché confrontant six variétés de printemps semées à l’automne ou au printemps : les variétés semés au printemps sont deux fois plus contaminées que les semis d’automne (Orlando, 2009) ; Ces résultats vont dans le sens de la seconde hypothèse citée plus haut : les semis tardifs fleurissant plus tard seraient plus exposés à la libération des spores de Fusarium producteurs de toxines T-2 et HT-2. Toutefois ce comportement n’est pas à généraliser à toutes les céréales et tous les climats car on retrouve la tendance inverse sur les avoines anglo-saxonnes (Edwards 2007)
Le précédent cultural a également un impact tout aussi important, les céréales à paille -et l’orge en particulier- induisant plus de toxines T-2 et HT-2 sur la culture d’orge suivant. Ce constat est également fait sur les avoines françaises (Orlando, 2009) et anglo-saxonnes (Edwards, 2007). Nous sommes donc ici dans une situation opposée à celle de la problématique DON où les précédents céréales à paille induisent moins de DON que des précédents comme le maïs (Barrier-Guillot et al., 2006).
Le travail du sol a un impact moindre sur les teneurs en toxines T-2 et HT-2. Seul, ce facteur n’apporte pas d’explication significative mais en revanche il complète l’information apportée par le précédent cultural. On retrouve ici un principe bien connu également retrouvé dans les avoines anglo-saxonnes (Edwards 2007) : tout ce qui favorise la décomposition des résidus restreint le substrat sur lequel s’installe le Fusarium, limitant ainsi le développement du champignon sur la culture suivante. Le labour est donc un atout pour les précédents céréale à paille ; il est bien connu qu’il permet de diminuer significativement les niveaux de contamination en DON.
Le comportement a priori différent des variétés vis-à-vis des teneurs en toxines T-2 et HT-2 est à approfondir par l’étude de réseaux d’essais dédiés. Les variétés d’avoine semblent également se comporter différemment (Edwards 2007) mais aucune donnée n’est actuellement disponible sur les cultures d’orges.
Enfin, on pourrait supposer que le traitement fongicide permettrait de limiter le développement de la maladie et donc des toxines produites. Nous n’avons pas pu mettre en évidence cet impact dans notre étude, et là encore la mise en place d’essais dédiés sur des années climatiques plus « à risque » nous permettrait d’avancer sur le sujet. Toutefois, une étude Suédoise récente menée sur les avoines montre que l’impact des fongicides est faible ou nul (Pettersson, 2008).
CONCLUSION
Cette étude a permis d’identifier les premiers leviers agronomiques influant les teneurs en toxines T-2 et HT-2 des orges. Cette démarche d’enquêtes est toujours en cours en 2009. Plusieurs années d’étude seront encore nécessaires pour bien identifier et hiérarchiser les itinéraires techniques à risque, et définir les séquences climatiques déterminantes pour les années critiques.
Parallèlement, la recherche doit encore progresser pour mieux comprendre la biologie des
Fusarium responsables : compétition entre les espèces, optimums climatiques, toxicologie.
contrôlées car les paramètres permettant de favoriser le développement du champignon ne sont pas bien connus. La connaissance de ces éléments permettrait de répondre à un certain nombre de questions pratiques par la mise en place d’essais en conditions contrôlées.
REMERCIEMENTS
Nous remercions le Conseil Général Ile-de-France (2006), BAYER-CropScience (2008), l’Agence Nationale de la Recherche (2008), ainsi que l’ensemble des collecteurs et agriculteurs partenaires pour leur investissement et/ou leur soutien financier.
Nous remercions également l’équipe technique Arvalis-Institut du végétal de Villerable, qui a centralisé , nettoyé et préparé les échantillons de cette étude.
BIBLIOGRAPHIE
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LES GENES D'AVIRULENCE DE LEPTOSPHAERIA MACULANS ET DEFINITION DE