Pour chaque échantillon préparé, il est réalisé deux extractions d’ADN soit Ext1 et Ext2, en suivant les protocoles décrits ci-dessous. Parmi les six protocoles d’extraction sélectionnés pour l’étude, figure le protocole de référence OEPP basé sur la méthode d'extraction d'ADN à l'isopropanol proposée par Llop et al. (1999).
Protocole OEPP(2004) à l’isopropanol selon Llop et al.,1999. (P1).
500 µl d’extrait végétal sont centrifugés à 13000 rpm durant 5 min à température ambiante. Après élimination du surnageant sans abîmer le culot obtenu, ce dernier est additionné de 250 µl de tampon d’extraction stérilisé par filtration (Tris HCL pH 7,5 24,2g, NaCl 14,6 g, EDTA 9,3 g, SDS 5 g, PVP 10 20 g, Eau 1 litre), vortexé et agité doucement pendant 1 heure à température ambiante (145 tours/min). Il est centrifugé à 5000 rpm pendant 5 min à température ambiante puis 200 µl de surnageant sont transférés dans un nouveau tube Eppendorf. 200 µl d’isopropanol sont ajoutés puis l’ensemble est mélangé doucement en retournant plusieurs fois et laissé 30 min à 1 heure à température ambiante. Le mélange est ensuite centrifugé à 13000 rpm durant 5 min à température ambiante puis le surnageant est éliminé. Les tubes sont retournés et laissés à sécher pendant 1h (tube ouvert) à température ambiante. Au final, l’ADN purifié est re-suspendu avec 100 µl d’eau ultra pure. L’ADN ainsi extrait peut être conservé au congélateur jusqu’à la réalisation de la PCR.
Protocole Easy-DNA-Extraction Kit (Pastrik et al ,2000) (P2).
Dans un tube eppendorf de 2 ml, sont mélangés 100 µl d’extrait végétal et 220 µl de tampon de lyse (Tris-HCl pH 8 1,21 g, NaCl 5,85g, EDTA pH 8 0,37 g, eau 1 litre) puis placés à 95°C durant 10 min, et refroidis à –18°C au moins 5 min. 80 µl de solution stock de lysosyme (50 mg/ml dans 10 mM Tris-HCl pH 8) sont additionnés et le mélange est homogénéisé et placé en incubation à 37°C durant 30 min.
L’ADN est ensuite purifié à l’aide du kit Easy -DNA- Extraction. 220 µl de solution A (kit) sont additionnés à la préparation, le tout est homogénéisé et placé en incubation à 65 °C pendant 30 min. Par la suite sont ajoutés 100 µl de solution B (kit) puis 500 µl de chloroforme suivi d’une homogénéisation. Après centrifugation à 20000 g pendant 20 min à 4 °C, la phase aqueuse supérieure est transférée da ns un nouveau tube. L’ADN est précipité avec de l’éthanol 96 % glacé (vol/vol) soit 1 ml. Il est mis au congélateur ( -18°C) pendant 10 min après une brève homogénéisation au vortex. Une centrifugation à 20000 g pendant 20 min à 4°C permet d’éliminer l’éthanol. L ’ADN est nettoyé avec de l’éthanol 80 % glacé (vol/vol) soit 500 µl, en mélangeant par de délicats retournements puis en centrifugeant à 20000 g pendant 20 min à 4°C . Au final, le surnageant est éliminé et le tube est laissé à sécher à l’air libre pendant au moins 15 minutes. L’ADN purifié est remis en suspension dans 100 µl d’eau ultra pure. Après stabilisation 20 minutes à température ambiante, il est conservé congelé ( -18°C) jusqu’à l’analyse.
Protocole REDExtract-N-Amp TM Plant PCR kit (Stöger et al , 2006) (P3).
Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml sont mélangés 100µL d’extrait végétal et 250 µl de solution d’extraction (kit) auquel sont additionnés 0,1 % (v/v ) de Triton X-100 et 0,05 % (v/v) de Nonidet NP-40 Igepal . Le mélange est homogénéisé et incubé à 95°C pendant 30 min. Mettre dans un nouveau tube Eppendorf 5 µl d’extrait obtenu contenant l’ADN purifié et ajouter 50 µl de solution de dilution (kit). L’ADN ainsi extrait peut être conservé au congélateur –18°C jusqu’à la réalisation de la PCR .
Protocole OEPP, kit ultra clean TM15-MO BIO (Manceau et al, 2005) (P4).
Dans un tube Eppendorf de 2 ml, déposer 100 µl d’extrait végétal, laisser macérer 30 min à température ambiante ou une nuit à 4°C et centrifug er à 13000g pendant 10 min à 4°C. Jeter le surnageant. Mettre le culot en suspension dans 120 µl de tampon de lyse (tampon Edwards : Tris –HCl : 24,2 g , NaCl : 14,6 g , EDTA : 9,3 g , SDS : 5 g , PVP 360 : 20 g ,
eau 1 litre) homogénéiser et incuber 10 min à température ambiante. Ensuite, centrifuger 10 min à 13000 g à 4°C. Prélever 100 µl de surnagent, y ajouter 300 µl de solution dénaturante d’iodure de Na (SALT du kit : Na2SO3 : 0,15 M, NaI : 7,5 M) et 5 µl de suspension de silice (BIND du kit :0,15 g/ml dans l’eau). Agiter doucement par inversion des tubes pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger 2 min à 13000g à 4°C et éliminer ensuite le surnageant en renversant le tube. Laver l’ADN présent dans le culot avec 1 ml de solution de lavage (WASH du kit : Tris HCl PH 7,4 : 20mM, EDTA : 1mM, Ethanol 50%). Centrifuger pendant 2 min à 4°C à13000g , puis éliminer le surnageant par renversement du tube. Laisser sécher à l’air minimum 15 min et mettre en suspension le culot en ajoutant 50 µl d’eau ultra pure, sans agiter mais en pipetant délicatement. Cette suspension est centrifugée à 13000 g pendant 2 min à 4°C et transférer 40 µl de surnage ant dans un tube stérile. L’ADN ainsi extrait peut être conservé au congélateur jusqu’à la réalisation de la PCR.
Protocole (Taylor et al , 2001) (P5).
200µL d’extrait végétal et 500 µl de tampon d’extraction (NaCl : 8,19 g , KCl : 3,73 g , Tween20: 0,5 g , PVP10: 20 g , BSA : 4 g , eau 1 L ) sont déposés dans un tube. L’ensemble est agité puis laissé 15 min à température ambiante. L’ADN extrait peut alors être conservé au congélateur (– 18°C) jusqu’à réali sation de la PCR.
Protocole Kit Microsynth (basé sur protocole OEPP, 2004) (P6).
Dans un tube Eppendorf, additionner 200µL d’extrait végétal avec 500µL de tampon d’extraction (Kit utilisé). Extraire l’ADN en déposant le tube dans un bloc chauffant pendant 20 min à 95 °C. Après 10 min, agiter le tube rapid ement puis chauffer de nouveau 10 min, et finir en agitant (si le tampon devient visqueux ajouter un peu de tampon pour diluer) . Agiter à la fin des 20 minutes. La solution obtenue peut être translucide, jaune ou brune. Centrifuger 2 min de 10000 à 17000 rpm à 4°C (soit 20000g = 13375 rpm) et transférer 500µL de surnageant dans un nouveau tube. L’ADN ainsi extrait peut être conservé au congélateur jusqu’à réalisation de la PCR. Avant d’effectuer l’analyse PCR , faire des dilutions au 1/10 ,1/100 , 1/1000 de l’extrait obtenu avec de l’eau ultra pure.
ANALYSE PAR BIOLOGIE MOLECULAIRE : Nested PCR
Après extraction de l’ADN, les échantillons sont soumis à une analyse par nested-PCR (PCR nichée) dans un seul tube (Llop et al , 2000) décrite dans le protocole OEPP (2004) qui utilise deux jeux d’amorces par réaction. En raison des différentes températures d’appariemen,t les deux réactions de PCR sont réalisées consécutivement. Les amorces externes sont celles désignées par McManus and Jones (1995), les internes sont celles décrites par Llop et al (2000). Les séquences sont les suivantes :
Amorces externes Aj75 : 5’ CGT ATT CAC GGC TTC GCA GAT
Aj76 : 5’ ACC CGC CAG GAT AGT CGC ATA
Amorces internes PEANT1 : 5’ TAT CCC TAA AAA CCT CAG TGC
PEANT2 : 5’ GCA ACC TTG TGC CCT TTA
Pour la nested-PCR, le mix et les conditions de réaction sont : eau 36,76µl ; tampon 10x 5µl ; MgCl250 mM 3µl ; dNTPs10 mM 1 µl ; Aj75 0,1pmol/µl 0,32 µl ; Aj76 0,1pmol/µl 0,32 µl ; PEANT1 10 pmol/µl 1 µl; PEANT2 10 pmol/µl 1 µl; ADN polymérase 5 U/µl 0,6 µl. Le volume d’échantillon est composé d’1 µl d’extrait d’ADN dans 49 µl de PCR mix. Les conditions de réaction sont : une étape de dénaturation à 94°C pe ndant 4 min suivie de 25 cycles à 94°C de 30 s et à 72°C de 1 min. Ce premier tour de PCR est suivi dans le même thermocycleur par une seconde étape de dénaturation à 94°C pendant 4 min et de 40 cycles à 94°C de 30 s, à 56°C de 30 s, et à 72°C de 45 s. Une étape finale à 72°C pendant 10 min termine la réaction. La taille de l’amplicon est de 391 bp, bien que des variations existent.
.
Llop et al (2000) sont observés. Pour cela, un gel à 1,5% d’agarose est préparé dans le tampon TAE 0,5X. 3 µl de goutte de bleu de charge sont mélangées à 20 µl de produit de PCR puis déposés dans les puits du gel ainsi que des témoins positifs et négatif et un marqueur de taille. Après migration pendant 20 min à 120 V (plateau moyen : 15x10 cm) ou 40 min à 160 V (pour un gros plateau de gel ou une cuve à électrophorèse : 15x25 cm), plonger le gel dans une solution de bromure d’éthidium pendant 20 minutes.
RESULTATS
L’évaluation intra-laboratoire des différentes méthodes d’extraction, première étape de la validation, est établie par comparaison des résultats obtenus avec les résultats de référence,
résultats attendus liés aux niveaux de contamination. Un exemple de traitement de résultat est présenté ci-dessous. Les résultats attendus pour les différents niveaux de contamination sont positifs à l’exception du niveau N0 pour lesquels ils sont négatifs.
Tableau I : Résultats de détection d’Erwinia amylovora selon le protocole d’extraction P2
Table I : Results of Erwinia amylovora detection following extraction protocol P2
L’analyse statistique des résultats obtenus avec les différents protocoles d’extraction permet de déterminer, selon les normes EN ISO 16140 et XP V03-111, les critères de performance suivants : le seuil de détection, la répétabilité, la justesse, l’exactitude relative, la spécificité et la sensibilité relatives des méthodes mises en œuvre.
S’agissant des résultats présentés ci-après, la table statistique et les sigles utilisés sont présentés dans le tableau VI.
Le seuil de détection est le niveau de contamination le plus bas pouvant être détecté par la
méthode. Au risque α =1%(risque d’écarter une méthode satisfaisante) , le seuil de détection est le niveau de contamination à partir duquel sont obtenus au plus 2 déviations entre doubles et au plus 2 accords négatifs entre doubles pour les échantillons positifs (pour q = 95%) selon les indications statistiques du tableau VI.
N° Echantillons N0 contamination zero N1 contamination 102ufc/mL N2 contamination 103ufc/mL N3 contamination 104ufc/mL N4 contamination 105ufc/mL N5 contamination 106ufc/mL ADN ext 1 ADN ext 2 ADN ext 1 ADN ext 2 ADN ext 1 ADN ext 2 ADN ext 1 ADN ext 2 ADN ext 1 ADN ext 2 ADN ext 1 ADN ext 2 1 Aubepine- - - - + 2 Cognassier - - - + + + + 3 Cognassier vieux - - - - 4 Cotoneaster - - - + + + + 5 Poirier - - - - + - - + + + - - 6 Neflier - - - + + + + 7 Poirier 1+2 - - - - + + + + + - + + 8 Pommier à cidre - - - - + + + + + + + + 9 Pommier vieux - - + - + + + - + + + + 10 Pyracantha - - - + + + + + + 11 Coing sain - - - + + + + + + +
Tableau II : Accords et déviations entre répétitions obtenus avec le protocole P2 pour les différents niveaux de contamination.
Table II : Accordances and deviations between doubles obtained with protocol P2 for different levels of contamination.
N0 N1 N2 N3 N4 N5
Nombre d’accords entre doubles (+ +) (- -) 11 10 9 9 10 10
Nombre d’accords positifs entre doubles (+ +) 0 0 3 4 8 8
Nombre d’accord négatifs entre doubles (- -) 11 10 6 5 2 2
Nombre de déviations entre doubles (+ -) 0 1 2 2 1 1
Total 11 11 11 11 11 11
Pour le protocole P2, le seuil de détection correspond au niveau de contamination N4 soit environ 105ufc/mL si q=95%.
La répétabilité intra-laboratoire quantifie l’homogénéité des résultats d’essai obtenus dans
dans des conditions similaires. Elle correspond à la proportion d’accord entre répétitions d’analyse de chaque échantillon.
Tableau III : Accords et déviations entre répétitions pour le protocole P2 et les différents niveaux de contamination.
Table III : Accordances and deviations between doubles for protocol P2 and different levels of contamination.
N0 N1 N2 N3 N4 N5
Nombre d’accords entre doubles (+ +) (- -)
11 10 9 9 10 10
Nombre de déviations entre doubles (+ -)
0 1 2 2 1 1
Total 11 11 11 11 11 11
q= 99% A=1 ok ok rejet rejet ok ok
q= 95% A=2 ok ok ok ok ok ok
q= 90% A=3 ok ok ok ok ok ok
Répétabilité 99% 99% 95% 95% 99% 99%
La justesse est définie par niveau de contamination en comparant les résultats de la méthode
avec les résultats attendus pour α =1% .
Tableau IV : Evaluation de la justesse du protocole P2 Table IV : Assessment of accuracy for protocol P2
N0 N1 N2 N3 N4 N5
Nombre d’accords avec les résultats attendus
22 1 8 10 17 17
Nombre de déviations avec les résultats attendus
0 21 14 12 5 5
Total 22 22 22 22 22 22
q= 99% A=1 ok rejet rejet rejet rejet rejet
q= 95% A=3 ok rejet rejet rejet rejet rejet
q= 90% A=5 ok rejet rejet rejet ok ok
Conclusion Juste si q=99% Non juste Non juste Non juste Juste si q=90% Juste si q=90%
L’exactitude relative (AC) est le niveau de correspondance entre la réponse attendue et la
réponse obtenue avec la méthode testée sur des échantillons identiques. Elle est obtenue par la formule : AC = 100(PA+NA)/(NA+PA+PD+ND) (PA, accord postif, NA, accord négatif, PD, déviation positive, ND, déviation négative).
La sensibilité relative (SE) (selon la définition de la norme ISO 16140) correspond à la
capacité de la méthode à détecter l’analyte lorsqu’il est considéré présent. Il est obtenu par la formule : SE = 100 PA/(ND + PA).
La spécificité relative (SP) (ISO 16140) : correspond à la capacité de la méthode à ne pas
détecter l’analyte lorsque l’échantillon est considéré non contaminé (échantillon sain). Il est obtenu par la formule : SP = 100 NA/(NA+PD).
Tableau V : Critères de performances pour le protocole P2. Table V : Performance criteria for protocol P2.
Exactitude relative (AC) Spécificité relative (SP) Sensibilité relative (SE) Protocole P2 56,8% 100,0% 48,2% Tableau VI : Statistiques Table VI : Statistics n 10 20 30 40 q (%) 99 95 90 99 95 90 99 95 90 99 95 90 α=1 % 1 2 3 1 3 5 2 4 7 2 5 9 α=5 % 0 1 2 1 3 4 1 4 6 1 4 7 Valeur de A pour α =10 % 0 1 2 1 2 4 1 3 5 1 4 6
n : nombre d’échantillons analysés en double
q : estimation de la proportion d’accords entre doubles ou d’accords avec les résultats de référence ou attendus
A : nombre maximum de déviations sur n échantillons pour ne pas rejeter l’hypothèse que la méthode alternative ait une proportion d’accords voisine de q au seuil α.
α : risque de rejeter une méthode satisfaisante (considérer à tord qu’une méthode présente une proportion d’accords inférieure à la valeur q choisie)
DISCUSSION
Les critères de performance du protocole P2 présenté dans l’exemple ne répondent pas aux attentes en termes de sensibilité et d’exactitude. Malgré une répétabilité correcte, le seuil de détection reste insuffisant pour que la méthode permette de mettre en évidence des infections latentes. L’extension de ce travail à un panel de protocoles publiés ou proposés sous forme de kits par des fournisseurs permettra de préciser leur intérêt.
Les résultats obtenus seront confrontés à ceux des autres partenaires du projet ERWINDECT pour classement et sélection des meilleurs protocoles afin de passer à la deuxième étape de validation : l’évaluation inter-laboratoires.
CONCLUSION
Des outils innovants de détection de la bactérie Erwinia amylvora agent du feu bactérien sont en cours de développement, d’optimisation et de validation.
Le protocole d’évaluation et de validation de méthodes d’extraction d’ADN présenté dans cette étude fournit des éléments permettant de mieux appréhender leurs critères de performances. Le projet EUPHRESCO-ERWINDECT devrait aboutir à un choix de méthodes de détection performantes pour la révision du protocole de l’OEPP.
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