Matériels et protocoles - Développement des agents bimodaux IRM/TEP et/ou IRM/TEMP

3.2 Développement des agents bimodaux IRM/TEP et/ou IRM/TEMP

3.2.2.1 Matériels et protocoles

Matériels

3.2.2.1.1 Contrairement au greffage des macrocycles DOTA sur les nanoparticules d’oxydes de fer, une

suspension de nanoparticules de Fe

O

-LDOPA (n’ayant subie aucune étape de lyophilisation) est utilisée

pour éviter la formation d’agglomérats lors de l’étape de lyophilisation. Cela permet d’avoir des

nanoparticules mieux dispersées. Pour réaliser les greffages, une suspension de Fe

O

-LDOPA synthétisée

à partir du dispositif hydrothermal (150°C, 25MPa, 80 mL/min) obtenue selon le run 1 ou une suspension

de Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

avec du NODAGA-NHS fourni par l’ICMUB et CheMatech sont utilisés. Du PBS 1M

(Phosphate Buffered Saline de Fisher Bioreagents) et du DMSO (Sigma BioReagent, ≥99.9%) sont

employés comme solvants.

Protocoles

3.2.2.1.2 - Protocole des nanoparticules Fe

O

-LDOPA-NODAGA :

Deux types de greffage Fe

O

-LDOPA-NODAGA ont été réalisés. L’un est réalisé en milieu PBS

(1x) et l’autre dans un milieu DMSO afin de comparer ces milieux de la même manière que pour les

synthèses effectuées avec le DOTA-NHS (Figure 87-A).

La première fonctionnalisation a lieu en milieu PBS (1M) à pH = 7,4. 2,0.10

-4

mol de Fe

O

(4,3.10

-5

mol de LDOPA) sont mélangés à 5,0.10

-5

mol de NODAGA-NHS (un TFA et un HPF

compris)

durant 4h.

Le tout est placé sous agitation magnétique. Un ajout de base NaOH est nécessaire pour

stabiliser le pH à 7,4. La suspension est ultrafiltrée (Amicon

UltraCel 30 KDa) puis une partie est

lyophilisée pour caractériser l’échantillon (sauf caractérisations DLS et radiomarquage).

* Compte tenu des résultats obtenus avec le DOTA (greffage suffisant et hydrolyse possible du groupement NHS du DOTA au cours de la synthèse) un ratio molaire LDOPA:NODAGA à l’équivalence est sélectionné.

La deuxième fonctionnalisation se déroule quant à elle en milieu DMSO. 1,0.10

-4

mol de Fe

O

(2,2.10

-5

mol de LDOPA) sont ajoutées au solvant ainsi que 2,6.10

-5

mol de NODAGA-NHS (avec un TFA et

un HPF

compris). Pour comparaison, le ratio molaire LDOPA:NODAGA-NHS est identique à celui définit

précédemment. Afin d’effectuer le greffage en milieu DMSO (V = 10 mL), le passage par l’état de poudre

Fe

O

-LDOPA a été nécessaire pour éliminer l’eau. La suspension est agitée durant 4 heures puis

ultrafiltrée (Amicon

UltraCel 30 KDa) puis une partie est lyophilisée (sauf caractérisations DLS et

radiomarquage).

- Protocole des nanoparticules Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA :

Le greffage du NODAGA-NHS sur des particules Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

se déroule selon le

protocole suivant : 1,6.10

-4

mol de Fe

O

(recouvertes de 3,7.10

-5

mol de LDOPA et 4,2.10

-7

mol de PEG

2000

)

sont introduites dans du PBS (1M) avec du NODAGA-NHS (5,0.10

-5

mol) durant 4 heures sous agitation

magnétique (Figure 87-B). Le ratio molaire LDOPA:NODAGA-NHS choisi est plus important à cause de la

présence de PEG susceptible de diminuer l’accès du NODAGA-NHS aux groupements amines de la LDOPA.

La suspension est ultrafiltrée (Amicon

UltraCel 30 KDa) puis lyophilisée (sauf caractérisations DLS et

radiomarquage).

Figure 87 : Protocoles de préparation des nanoparticules a) Fe3O4-LDOPA-NODAGA et b) Fe3O4-LDOPA-PEG2000-NODAGA

3.2.2.2 Validation du greffage

Les échantillons purifiés sont analysés par spectroscopie IR et XPS ainsi que par DLS,

zêtamétrie, XPS et ATG dans l’objectif de vérifier si les macrocycles sont présents à la surface des

nanoparticules.

Par spectroscopie infrarouge (Figure 88), les vibrations associées aux groupements –CH

(étirements symétriques et asymétriques) sont présentes à 2960, 2920 et 2860 cm

-1

.

297

A 1580 cm

-1

, les

vibrations des carboxylates COO

apparaissent.

297

Les amines tertiaires et les groupements C-O très

présents dans les macrocycles NODAGA apparaissent dans la région comprise entre 1360 et 1050 cm

-1

.

154, 306

Les vibrations OH et NH sont respectivement visibles à 3400 et 3240 cm

-1

.

288

La spectroscopie

Figure 88 : Spectres IR en mode ATR des poudres A) Fe3O4-LDOPA, Fe3O4-LDOPA-NODAGA (PBS) et Fe3O4-LDOPA-NODAGA (DMSO) et B) Fe3O4-LDOPA, Fe3O4-LDOPA-PEG2000 et Fe3O4-LDOPA-PEG2000-NODAGA (PBS)

L’ATG tend aussi à prouver la présence de ces nouvelles molécules organiques à la surface des

nanoparticules Fe

O

-LDOPA (Figure 89). En effet, une perte de masse plus importante est observée de

l’ordre de 6% pour les échantillons Fe

O

-LDOPA-NODAGA (PBS) et de 29% pour les échantillons

Fe

O

-LDOPA-NODAGA (DMSO) par rapport à l’échantillon Fe

O

-LDOPA et de 3% pour les poudres

Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA par rapport à Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

.

Figure 89 : ATG des courbes A) Fe3O4-LDOPA, Fe3O4-LDOPA-NODAGA (PBS) et Fe3O4-LDOPA-NODAGA (DMSO) et B) Fe3O4-LDOPA, Fe3O4-LDOPA-PEG2000 et Fe3O4-LDOPA-PEG2000-NODAGA

L’analyse XPS tend aussi à corroborer les précédentes observations (Tableau 17). Une fois les

molécules de NODAGA greffées sur les nanoparticules Fe

O

-LDOPA, une augmentation de la

concentration atomique en carbone et une diminution de la concentration atomique en fer sont observées.

La concentration atomique en fer (Fe2p) passe ainsi de 14% (Fe

O

-LDOPA) à 13%

(Fe

O

-LDOPA-NODAGA (PBS)) et 10% (Fe

O

-LDOPA-NODAGA (DMSO)). De même, cette concentration

passe de 15% (Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

) à 14% (Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA). Concernant la

concentration atomique en carbone (C1s), dans le cas où la fonctionnalisation s’est déroulée en milieu

PBS, une diminution par rapport à l’échantillon de référence est notée (41 % pour les nanoparticules

Fe

O

-LDOPA et 27% pour les nanoparticules Fe

O

-LDOPA-NODAGA (PBS)). Aucune explication sur cette

observation ne peut être fournie. Remarquons cependant que dans ce cas, l’ion sodium apparait en plus

grande proportion. Cet ion est connu pour former des complexes stables avec les macrocycles comme le

DOTA.

308

Ainsi, il est possible qu’une complexation de l’ion sodium issu de la base NaOH a eu lieu avec le

NODAGA au cours de l’étape de greffage modifiant ainsi les rapports de concentrations atomiques

déterminées par XPS. En milieu DMSO (sans la présence de sodium), la concentration atomique en C1s

augmente considérablement passant ainsi à 53%. Aucune évolution de cette concentration en carbone

n’est observée pour les échantillons Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA et Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

. Du

phosphore est retrouvé sur les nanoparticules Fe

O

-LDOPA-NODAGA (PBS) et

Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA ainsi que du fluor sur les nanoparticules Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA.

Ces éléments résultent de la présence initiale du TFA et du HPF

dans le NODAGA-NHS : ce sont des

résidus de la synthèse initiale du macrocycle. Aucune évolution de la concentration atomique en azote

n’est notée. Ainsi, les évolutions des concentrations atomiques en carbone, fer, phosphore et fluor

confirment la présence des macrocycles une fois le greffage réalisé.

Concentrations atomiques (%) Ratio

Echantillon C1s O1s N1s Fe2p Na1s F1s P2p C1s/Fe2p

Fe

O

-LDOPA 41 39 5 14 1 - - 2,9

Fe

O

-LDOPA-NODAGA (PBS) 27 40 3 13 11 2 2 2,0

Fe

O

-LDOPA-NODAGA (DMSO) 53 31 6 10 - - - 5,3

Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

(PBS) 39 41 5 15 2,6

Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA 38 41 5 14 1 - 1 2,7

Tableau 17 : Concentrations atomiques des poudres Fe3O4-LDOPA, Fe3O4-LDOPA-NODAGA (PBS), Fe3O4-LDOPA-NODAGA (DMSO), Fe3O4-LDOPA-PEG2000 et Fe3O4-LDOPA-PEG2000-NODAGA

Des évolutions des contributions N1s et C1s sont aussi observées lorsque les nanoparticules

sont fonctionnalisées par le macrocycle NODAGA. En effet, l’énergie de liaison de la contribution COH/CN

de la région C1s est décalée vers les hautes énergies. Elle passe respectivement de 285,7 eV à 286,0 eV

pour les échantillons Fe

O

-LDOPA et Fe

O

-LDOPA-NODAGA (PBS) (Figure 90). Par ailleurs, la proportion

relative à cette contribution augmente passant ainsi de 40% à 49% et 55% pour les échantillons

Fe

O

-LDOPA, Fe

O

-LDOPA-NODAGA (PBS) et Fe

O

-LDOPA-NODAGA (DMSO) respectivement (Figure

90). La modification de l’énergie de liaison s’explique par la présence de nombreuses amines tertiaires sur

les macrocycles NODAGA. L’environnement électronique est différent de celui des NH

(amine primaire)

encore libres ou NH (amine secondaire) de la LDOPA fonctionnalisée. Concernant les échantillons PEGylés

fonctionnalisés par le NODAGA en milieu PBS et les nanoparticules Fe

O

-LDOPA-NODAGA-(DMSO),

aucune évolution de l’énergie de liaison de la contribution COH/CN n’apparaît. La faible quantité greffée

dans le cas de ces deux échantillons peut expliquer l’observation précédente (Figure 89) (0,5, 1,0 et 1,9

Fe

O

-LDOPA-NODAGA-(DMSO), Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA et Fe

O

-LDOPA-NODAGA-(PBS)). De

même, la concentration relative à la contribution COH/CN diminue passant de 44 à 41% pour les

nanoparticules Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

et Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA. Dans le cas des échantillons

PEGylés la couche de PEG

2000

peut masquer le macrocycle.

Sur l’ensemble des échantillons analysés, aucune évolution de la contribution COOH n’est notée.

Concernant la région N1s, des modifications apparaissent également. Lorsque la molécule

organique NODAGA est greffée, une nouvelle contribution à 398,2 eV liée au groupement C-N du

macrocycle apparaît sur les nanoparticules Fe

O

-LDOPA-NODAGA-(PBS). Aucune évolution de cette

dernière sur les nanoparticules Fe

O

-LDOPA-PEG

2000

-NODAGA n’est notée.

Figure 90 : Contributions C1s, N1s, F1s, P2p des poudres A) Fe3O4-LDOPA, B) Fe3O4-LDOPA-NODAGA (PBS) C) Fe3O4-LDOPA-PEG2000, D) Fe3O4-LDOPA-PEG2000-NODAGA et E) Fe3O4-LDOPA-NODAGA (DMSO)

Ainsi, les nouvelles vibrations en infrarouge, les pertes des masses plus importantes en ATG et

les évolutions des régions C1s et N1s en XPS confirment la présence des macrocycles NODAGA à la surface

des nanoparticules.

Dans le document Nanoparticules de magnétite fonctionnalisées pour l'imagerie bimodale IRM/TEP (Page 189-195)