Préparation des solutions de peptides Aβ.
Les peptides Aβ16, Aβ28, Aβ40, Aβ42 ont soit été synthétisés par processus standard Fmoc et purifiés par HPLC avec une colonne C8 par Honoré Mazarguil (IPBS, Toulouse), soit achetés à EZBiolab (Westfield, IN, USA), Geneshere Biotechnologies (Paris, France) ou Activotec (Cambridge, UK). L’ESI-MS des peptides Aβ16, 28, 40 et 42 montre des masses, pour les espèces monochargées, correspondantes aux masses calculées à moins de 0,3 unités près.
Les solutions stocks de peptides sont préparées en dissolvant les peptides dans l’eau ou directement dans le tampon de travail à pH 9-10 pour faciliter leur dissolution et s’assurer qu’ils sont sous forme monomérique. Le pH est ensuite ajusté. Les solutions sont conservées à -20 °C. Dans ces conditions, elles sont stables plusieurs semaines. Les spectres RMN 1H des
peptides Aβ16, Aβ28, Aβ40 ont montré qu’il n’y avait aucune dégradation ni agrégation des peptides dans ce laps de temps.
La concentration des peptides est déterminée par spectroscopie d’absorption UV-Vis en utilisant le coefficient d’absorption de la Tyr à λ = 276 nm, ε = 1410 cm-1.M-1 (Gill and von
Hippel 1989). La structure des peptides est principalement “random coil” et la Tyr10 se comporte donc comme une Tyr libre. Il est donc raisonnable de considérer qu’elle a le même coefficient d’absorption molaire qu’une Tyr libre. A partir de la Loi de Beer-Lambert, A = ε.l.c (où l = 1 cm), un simple spectre d’absorption permet de déduire la concentration du peptide.
Préparation des solutions de métaux.
Les solutions de métaux sont préparées par pesée d’une masse de sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO4, 7 H2O, Alfa Aesar), chlorure de cuivre dihydraté (CuCl2, 2 H2O, Sigma) ou chlorure
de cadmium (CdCl2, Aldrich) diluée dans l’eau. Ces solutions mères stocks sont conservées à
-20°C. Elles sont ensuite diluées dans le tampon approprié jusqu’à 1 mM, 500 ou 100 μM. L’ajout d’HCl avant dilution est généralement nécessaire afin d’éviter la formation de
précipité d’hydroxydes Métal(OH)2.
Spectroscopie d’absorption UV-visible
Les spectres d’absorption UV/Visible ont été réalisés à température ambiante avec les spectromètres Cary 2300 et Agilent 8453 dans une cuve en quartz de 1 cm de large.
Etude de la diffusion par RMN à écho de spin avec gradient de champ magnétique pulsé (Pulse Gradient Spin-Echo Nuclear Magnetic Resonnance, PGSE NMR)
La mesure de la diffusion d’une particule permet d’en déduire son rayon hydrodynamique et ainsi sa taille. Soit kB la constante de Boltzmann, T la température, f le coefficient de friction :
La formule du coefficient de friction donnée ici correspond au cas d’une particule sphérique, où η est la viscosité du liquide et r le rayon de Stockes de la particule diffusante.
La séquence de base du gradient de champ pulsé est représentée sur la figure 3.7. A l’état initial, l’ensemble des spins des noyaux des atomes d’hydrogènes est en équilibre thermique et orienté suivant l’axe z, c’est-à-dire parallèle au champ magnétique statique. A t0 on
applique, pendant un cours instant, un champ de π/2 suivant l’axe des x afin d’orienter les spins dans le plan perpendiculaire au champ magnétique statique. Ensuite un premier gradient de champ pulsé est appliqué de manière à induire un déphasage des spins en fonction de leur position suivant z. A la fin de la première période τ, un champ pulsé π selon l’axe y permet d’inverser le signe de la phase. Ainsi, lorsque l’échantillon reçoit le 2ème gradient de champ pulsé identique au premier, les particules ne s’étant pas déplacées suivant z voient le déphasage de leur spins nucléaires entièrement compensé, les autres restent déphasées proportionnellement à leur déplacement suivant z entre l’application des deux champs de gradient. Si toutes les particules ne se sont déplacées uniformément, on obtient une
Mesure de la diffusion Taille de la molécule Loi de Stokes-Einstein: D = kB.T/f où f = 6π.η.rs
distribution de phase et une atténuation du signal RMN. On associe enfin à chaque signal du spectre RMN 1H de la solution un coefficient de diffusion.
Figure 3.7. Représentation schématique d’une séquence RMN à gradient de champ pulsé (Price 1997).
Les expériences de RMN ont été effectuées avec un spectromètre Bruker Avance500 équipé d’une sonde 5mm triple résonance inversée selon z. Toutes les mesures ont été réalisées selon la séquence pulsée BPLED (Wu, Chen et al. 1995) avec un retard de 5 ms (Te) des courants de
Foucault. La température a été fixée à 291 K. Le délai de recyclage a été ajusté à 10 secondes afin de permettre une complète relaxation. La forme du gradient était rectangulaire avec une longueur de 2,6 ms pour Aβ40 et 2,4 ms pour Aβ28 et Aβ16, la force variant selon 16 in
créments (2-95 %) selon la rampe du gradient créé par le logiciel de Bruker DOSY (Diffusion Ordered Spectroscopy). La force du gradient a été calibrée par mesure de l’auto-diffusion du signal résiduel HDO dans un échantillon à 100% D2O à 298 K (1,90.10-9 m2.s-1). Le temps de
diffusion Δτ a été pris égal à 180 ms pour Aβ40 et 150 ms pour Aβ28 et Aβ16. Le signal résiduel de l’eau a été supprimé par une séquence WATERGATE. Les échantillons n’ont pas été mis en rotation pour éviter une surévaluation du coefficient de diffusion (remarquée expérimentalement). Tous les échantillons ont été préparés dans D2O pur et le pH a été ajusté
à environ 7,4. Les coefficients de diffusion ont été déterminés en fittant avec la méthode des moindres carrées les points obtenus par l’équation de Stejskal-Tanner en utilisant l’algorythme Simfit du logiciel de Bruker T1/T2.
Le rayon hydrodynamique a été calculé d’après les coefficients de diffusion obtenus expérimentalement selon la relation de Stockes-Einstein (He and Niemeyer 2003).
r T k D B . . 6 . η π =
avec D le coefficient de diffusion (cm2.s-1), T = 291 K, ηD2O = 1,3.10-3 kg.m-1.s-1 et r le rayon
hydrodynamique (m). Les valeurs de coefficients de diffusion mesurées pour l’apo-Aβ sont respectivement de 1,39 ; 1,06 et 0,93.10-10 m2.s-1 pour Aβ16, Aβ28 et Aβ40 ; et 1,42 ; 1,19 et 1,08.10-10 m2.s-1 pour les complexes ZnII-Aβ.
Chromatographie d’exclusion stérique (SEC)
L’analyse séparative des mélanges d’oligomères d’Aβ en présence et absence de métaux (Cu(II) et Zn(II)) est réalisée par chromatographique d’exclusion stérique couplée à une FPLC. Elle est effectuée à température ambiante sur une colonne superdex 75 10/300 GL avec une instrumentation AKTA (Amersham Pharmacia Biotech) sous des conditions isocratiques. L’éluant utilisé est une solution tampon de 20 mM de Hepes à pH 7,4 contenant 100mM de NaCl. Son débit est généralement de 0,4 ml.min-1. L’absorption a été enregistrée aux 3 longueurs d’ondes : 220 nm, 276 nm et 600 nm. Le système est calibré avec les molécules globulaires de rayons hydrodynamiques connus suivantes: l’albumine (35,5 Å, 67kDa), la ribonucléase A (17,5Å ; 13,7 kDa), le cytochrome C (17 Å ; 12,3 kDa), l’aprotinine (13,5 Å; 6,5 kDa), la vitamine B12 (8,5 Å ; 1,35 kDa). Les oligonucléotides (de séquences 5’- CGTACG et 5’-TCCATATCACAT) ont été donnés par G. Pratviel et B. Meunier (LCC, Toulouse). Après équilibration de la colonne avec élution du tampon 20 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.4 (2 volumes de colonne), 100 μl d’échantillons de protéines (concentration
comprise entre 10 et 200 μM) sont injectés. Le pic d’Aβ est collecté puis quantifié par absorption.
Sous ces conditions, le complexe Aβ-Zn perd partiellement le zinc. Des expériences similaires ont donc été effectuées en présence de 50 ou 100 μM de ZnCl2 dans le tampon
d’élution afin de maintenir le zinc fixé au peptide (Kd de l’ordre du micromolaire). Les concentrations de zinc ont été mesurées avec le 4-(2-pyridylazo)-resorcinol (PAR) (Ciuculescu, Mekmouche et al. 2005). Le PAR, de plus forte affinité que Aβ pour le zinc, forme des complexes 1:1 et 2:1 avec Zn(II), ainsi l’utilisation d’un large excès de PAR permet à plus de 99 %du zinc(II) présent de former un complexe 2:1 avec le PAR : Zn(PAR)2. Celui-
ci est caractérisé par un maximum d’absorbance à 490 nm (ε = 66000 M-1.cm-1) (Shaw, Laib et al. 1990; Walkup and Imperiali 1997).
La quantité de cuivre présente dans la fraction a été estimée par l’absorbance à 600 nm (ε = 60 M-1.cm-1) et par test colorimétrique test avec la bathocuproïne (Poillon and Dawson 1963). Dans ce test, le Cu(II) est d’abord réduit en Cu(I) par addition d’un excès d’acide ascorbique (30 équivalents). Le Cu(I) est ensuite complexé par la bathocuproïne, qui exhibe alors une bande de transition à 480 nm (ε = 13500 M-1.cm-1). L’acide bathocuproïne disulfonique (Acros) est 10 fois en excès.
Etude de l’agrégation
Des solutions de 50 μM d’Aβ40 monomérique (tampon Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) ont été incubés pendant 3 heures à 37°C, sous agitation modérée, en présence ou non de métal. La déféroxamine (achetée chez Sigma, figure 3.8) a été utilisée pour chélater d’éventuelles traces de métaux. Les échantillons ont ensuite été centrifugés 30 min à 21000g à 4°C. Les fractions d’Aβ40 soluble et agrégé ont été déterminées en mesurant le contenu en peptide des culots et surnageants grâce au test colorimétrique de détection de protéines BCA (Pierce, Rockville CA).
Le test BCA est étalonné à partir de solutions d’albumine de sérum bovin de concentration connue (Smith, Krohn et al. 1985). Le réactif de détection est composé d’acide bicinchoninique (BCA) et de sulfate de cuivre (II) en présence d’hydroxyde de potassium. Le principe du test repose sur la réaction de réduction des ions cuivriques en ions cuivreux par les liaisons peptidiques en milieu très alcalin. Les ions Cu+ sont ensuite captés spécifiquement par le BCA pour former un complexe 2:1 exhibant une bande d’absorption à 562 nm (Figure 3.9).
Figure 3.9. Réactions conduisant à la détection colorimétrique des protéines par le test BCA.
Ce test colorimétrique possède plusieurs avantages, puisqu'il est :
- quantitatif, sensible (détection à partir de 0,02 μM d’Aβ) et linéaire dans la gamme de concentration de protéine étudiée (jusqu'à 6 μM d’Aβ),
- relativement peu dépendant de la séquence de la protéine puisque ce sont les liaisons peptidiques qui réagissent lors du dosage et non les résidus des acides aminés (comme par exemple le test de Bradford basé sur la coloration des arginines).
- - compatible avec l'utilisation de CuII et de chélateurs d'ions métalliques aux concentrations de l'étude.
Il est toutefois préférable d’utiliser la protéine ou le peptide étudié plutôt que la BSA lors de l’étalonnage. En effet, des différences parfois significatives ont été trouvées entre la concentration initiale réelle et celle déduite des tests BCA.
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Chapitre 4
Etude structurale du mécanisme de
promotion de l’agrégation du peptide
I. Introduction
Les amyloïdoses sont caractérisées par un repliement et un assemblage anormal d’une protéine, conduisant à la déposition de fibres de protéines insolubles (amyloïdes), provoquant ensuite des dysfonctionnements cellulaires suivis de la mort des cellules (revues : (Sacchettini and Kelly 2002; Chiti and Dobson 2006)). Il faut noter cependant, comme énoncé dans le chapitre 1, que toutes les amyloïdoses ne sont pas pathologiques, des amyloïdoses fonctionnelles ont récemment été découvertes dans un certains nombres d’organisme vivants, dont l’homme (Fowler et al. 2007). Plus de 20 protéines ou peptides différents ont été rapportés former des dépôts amyloïdes in vivo. Bien que ces protéines n’aient pas de lien évident entre elles, tant au niveau de leur séquence peptidique que de leur fonction, elles polymérisent en des fibres similaires d’un diamètre d’environ 10 nm (Pepys 2006), organisées en structure dite « cross bêta » et pouvant être révélées par des marqueurs amyloïdophiles tels la Thioflavine T (ThT) ou le rouge Congo.
Ces protéines peuvent ou non avoir une structure native définie. Quand c’est le cas, comme pour le lysozyme et la transthyrétine, le changement conformationnel nécessaire à la formation de structures amyloïdes, passe par une déstabilisation de la structure native du fait de mutations ou de facteurs environnementaux défavorables (Ohnishi and Takano 2004; Jahn and Radford 2005). Dans le cas de protéines ou peptides non structurées, tel que Aβ ou l’alpha-synucléine, la structure du monomère initiateur de l’arrangement en feuillets bêta n’est pas connu. Teplow et ses collaborateurs (Walsh et al. 1997; Walsh et al. 1999; Kirkitadze et al. 2001) ont rapporté des indications en faveur de l’existence d’un intermédiaire de structure partiellement hélice alpha dans la formation de fibres amyloïdes à partir de peptide Aβ majoritairement non structuré. Cette hypothèse est également confirmée par le fait que, en présence d’environ 20 % de 2,2,2-trifluoroéthanol (TFE) connu pour promouvoir les structures en hélice, la formation de fibres est favorisée (Fezoui and Teplow 2002). Cette effet cesse à des concentrations supérieures en TFE pour lesquelles le taux d’hélices alpha augmente, soulignant ainsi l’importance d’une conversion partielle en hélice alpha.
Un des facteurs environnementaux physiologiques capable d’affecter la conformation et ainsi les propriétés d’agrégation des protéines et peptides amyloïdogéniques, est la présence d’ions métalliques tels le zinc(II) et le cuivre(II). Le zinc a été rapporté se lier à diverses protéines et peptides comme Aβ, le prion, l’alpha-synucléine, la transthyrétine Abri, etc (Bush et al. 1994; Atwood et al. 1998; Khan et al. 2004; Gaggelli et al. 2005; Binolfi et al. 2006; Wilkinson-
White and Easterbrook-Smith 2007). Généralement le zinc favorise l’agrégation de la protéine ou du peptide amyloïdogénique. Dans le cas de Aβ, dont l’interaction avec le zinc est une des mieux décrite, la structure des agrégats a été décrite comme étant majoritairement amorphe (dépendant des conditions expériementales et temps d’incubation). En effet les agrégats induits par le zinc semblent moins réagir avec la ThT que ceux formés en l’absence de zinc (Yang et al. 2000; Yoshiike et al. 2001; Klug et al. 2003; House et al. 2004; Raman et al. 2005).
Comme indiqué dans le premier chapitre, le site de fixation du zinc est localisé sur la partie N-terminale de Aβ (acide aminés 1 à 16). Plusieurs études utilisant Aβ40 ou les formes courtes de Aβ (Aβ16 et 28) ont tenté d’identifier les ligands du zinc (Liu et al. 1999; Miura et al. 2000; Yang et al. 2000; Curtain et al. 2001; Kozin et al. 2001; Zirah et al. 2003; Mekmouche et al. 2005; Hou and Zagorski 2006; Stellato et al. 2006; Syme and Viles 2006; Zirah et al. 2006; Danielsson et al. 2007). Bien qu’il y ait quelques contradictions, l’implication des histidines 6, 13 et 14 sont suggérés par la plupart des publications. Les conclusions concernant d’autres ligands concordent moins, le plus fréquemment évoqué étant l’aspartate en position 1, via la fonction amine terminale ou du groupement carboxyle du résidu (Zirah et al. 2003; Mekmouche et al. 2005; Danielsson et al. 2007). Dans le cas d’un N-terminus acétylé, la structure RMN du complexe ZnII-Aβ16 a été résolue et indique que le zinc est lié aux trois histidines et au glutamate 11 (Zirah et al. 2006).
Cependant, le mécanisme de promotion de l’agrégation par le zinc est mal connu. Le but de ce chapitre est donc d’essayer de comprendre l’effet du zinc sur l’agrégation de Aβ en présence de TFE, ainsi que le rôle de l’intermédiaire partiellement structuré en hélice alpha. Cette étude a été menée avec le peptide Aβ28, contenant le site de fixation du zinc, qui a l’avantage d’agréger beaucoup plus lentement que Aβ40 et 42, rendant ainsi possible les études spectroscopiques avec un suivi dans le temps, tout en ayant la capacité à former des fibres amyloïdes classiques (Kirschner et al. 1987).8
8 Le zinc(II) a été choisi préférentiellement au cuivre(II) car sa liaison aux histidines ou carboxylates n’absorbe
pas dans la région correspondante aux liaisons peptidiques (190-240 nm). Ainsi les changements observés lors de l’ajout du métal dans le spectre de dichroïsme circulaire ne sont dus qu’à des modifications dans la structure secondaires du peptide. Ce n’est pas le cas du cuivre qui absorbe dans cette région via la liaison aux histidines.
II. Résultats et discussion
Le degré d’agrégation de Aβ28 en présence ou non de zinc(II) et en fonction de la teneur en TFE est donné sur la figure 4.1. Différentes méthodes ont été utilisées pour mesurer l’état d’agrégation. Premièrement, après 30 minutes d’incubation puis centrifugation, les quantités de peptide contenues dans le surnageant et le culot ont été mesurées avec le test BCA (voir Matériels et méthodes). Cette analyse montre qu’en l’absence de zinc, l’agrégation de l’apo- Aβ28 est faible quelque soit la teneur en TFE de la solution (0 à 40 %). Par contre, la présence d’un équivalent de zinc(II) induit une précipitation dont l’importance dépend du pourcentage de TFE : très faible en l'absence de TFE (~10 %), elle est quasi-totale à 10 % de TFE, puis diminue progressivement jusqu’à retrouver des valeurs très faibles pour une teneur en TFE de 40 %. 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 % TFE % agrég a ti o n e t i n te nsi té d e fl o re s ce n c e r e la ti ve
Figure 4.1. Pourcentage d’agrégation (déterminé avec le test BCA et par mesure de l’absorption du surnageant S) ou intensité de fluorescence relative du à la fixation de ThT z,
après 30 minutes d’incubation à 37°C, en fonction de la teneur en TFE de la solution, en absence (en pointillé) ou en présence (lignes pleines) d’un équivalent (50 μM) de zinc(II).
Les agrégats ont également été analysés par coloration à la ThT. Celle-ci se fixe