c Evolution du stress oxydant avec l’âge

La production d’espèce réactives de l’oxygène (ROS) est une des principales hypothèses pour expliquer le processus de vieillissement (Harman 1956; Barja 2004). C’est également une

hypothèse pour l’apparition de la MA. Ce phénomène est en effet d’une ampleur considérable puisqu’il semble qu’environ la moitié des protéines d’un animal sénescent soient oxydées (Gafni 1997). Les ROS sont dérivés de la réduction univalente de l’oxygène et incluent les espèces telles que l’anion superoxyde, le peroxyde d’hydrogène et les radicaux hydroxyles. Les ROS peuvent être produits au sein de l’organisme via une grande variété de mécanismes, cependant la réaction de l’oxygène avec des métaux à activité redox, lié ou non à des protéines, est la principale source de ROS (Halliwell and Gutteridge 1984). Une petite quantité de ROS peut être bénéfique à la cellule en jouant le rôle de messager, régulateur de gènes ou médiateur de l’activation cellulaire. Cependant une augmentation de leur concentration peut entraîner de nombreux effets néfastes : peroxydation des lipides (Gupta et al. 1991; Cini and Moretti 1995; Zhu et al. 2006), inactivation d’enzymes, altération des structures tertiaires de protéines (Forster et al. 1996; Poon et al. 2006) et oxydation de l’ADN (dont l’ADN mitochondriale) (Hamilton et al. 2001). Parallèlement, on observe une diminution, avec l’âge, de l’ensemble des mécanismes de défense contre les ROS (métalloenzymes comme la catalase, glutathion, vitamine E/C, …) (Gracy et al. 1985; Rosenberger 1991).

Dans les cerveaux de personnes atteintes de la MA, le stress oxydant semble encore plus important : un taux élevé en lipides peroxydés et la présence de nombreux produits d’oxydation de protéines et d’ADN ont été observés (Butterfield and Lauderback 2002; Keller et al. 2005; Sultana et al. 2006).

II.4.d. Modulation des métaux dans la MA

De nombreuses études ont montré la présence d’un déséquilibre de l’homéostasie des métaux de transition dans le cerveau (hippocampe, amygdale, néocortex et bulbe olfactif) des personnes atteintes de la MA (Adlard and Bush 2006). En effet, on remarque une augmentation (facteur 3 à 5) en zinc, cuivre et fer dans les noyaux cortico-médians et baso- latéraux de l’amygdale, mais les plus grandes concentrations se situent au niveau des plaques amyloïdes : 390 μM de cuivre, 1050 μM de zinc, 940 μM de fer, à comparés aux concentrations de 70, 350 et 340 μM respectivement chez le sujet sain (Lovell et al. 1998). Des analyses histochimiques ont également montré une concentration élevée en zinc au niveau des neurofilaments et des dépôts amyloïdes caractéristiques de l’angiopathie amyloïde (Suh et al. 2000). Dans le sérum et le liquide céphalorachidien (LCR), les résultats diffèrent suivant les études, par exemple : diminution du taux de fer et zinc et une élévation du taux de

cuivre (Basun et al. 1991), ou diminution en zinc dans le LCR (mais pas en fer, cuivre ni manganèse) et pas de changement notable dans le sérum (Molina et al. 1998). Les principaux transporteurs de ces métaux (céruloplasmine, protéine de transport du zinc ZnT1, métallothionéines, protéines liées au fer) semblent également connaître des altérations régio- spécifiques lors de la MA (Uchida et al. 1991; Connor et al. 1993; Adlard et al. 1998; Smith et al. 1998; Yu et al. 2001; Bishop et al. 2002; Lovell et al. 2005; Moreira et al. 2005). Ainsi il apparaît assez clairement une perturbation significative de l’homéostasie du cuivre, fer et zinc chez les personnes atteintes de la MA. Compte tenu des rôles multiples des ces ions métalliques au sein de l’organisme et en particulier du système nerveux central (SNC) (maintient des fonctions enzymatiques et mitochondriales (Yamaguchi et al. 1982; Rossi et al. 2004), immunité (Percival 1998), myélination (Hara and Taketomi 1986; Wegner 2000), apprentissage et mémoire (Youdim and Yehuda 2000; Bhatnagar and Taneja 2001; Takeda 2001), etc…) leur dérégulation participe inévitablement au spectre des altérations caractéristiques de la MA. Cependant, l’interaction de ces métaux avec le peptide Aβ suggère qu’une dérégulation de leur homéostasie pourrait être fondamentalement impliquée dans la MA en tant que cause et pas seulement en tant que conséquence.

II.4.e.Implication des métaux dans la MA Implication de métaux toxiques

Dans le cas de métaux particulièrement toxiques comme le plomb, le mercure et le cadmium, la démonstration de leur implication dans différents processus contribuant à la neurodégénération est largement établie (Weisskopf et al. 2004; Bleecker et al. 2005; Lanphear et al. 2005). Leur lien éventuel avec la MA est moins clair. Une surexposition au plomb en début de vie pourrait favoriser ensuite l’élévation d’APP et Aβ (Basha et al. 2005). Une théorie concernant l’aluminium est également présente dans la littérature. Il a ainsi été impliqué dans la formation des neurofilaments, dans l’agrégation et la toxicité d’Aβ (cf. revues (Gupta et al. 2005; Kawahara 2005)). Ce métal, sans activité redox intrinsèque, pourrait également promouvoir le stress oxydant via la formation du radical AlO2y2+ facilitant

les oxydations biologiques dues à l’ion superoxyde (oxydation du coenzyme NADH, accélération de l’oxydation due au fer, peroxydation des lipides) (Exley 2004). Cependant, l’aluminium, qui n’a pas de fonction biologique, a des propriétés toxiques, son implication dans la MA demeure donc controversée (Forbes and Hill 1998; Munoz 1998).

D’un point de vue thérapeutique, la desferrioxamine (DFOA), utilisée depuis 1963 comme chélateur du fer puis de l’aluminium en 1980 (Keberle 1964; Ackrill et al. 1980; Arze et al. 1981; Swartz 1985; Domingo 1989), semble ralentir le développement de la maladie (McLachlan 1991), mais l’existence d’effets secondaires ne permet pas un traitement sur la durée (Kruck et al. 1990; McLachlan 1991; Domingo 1996). De plus, l’administration de DFOA n’empêche pas la formation de neurofibrilles comme escompté, son action est donc probablement anti-oxydante et anti-inflammatoire non spécifique (Savory et al. 1994). Des résultats plus encourageants ont cependant été décrits, en laboratoire, avec des composés comme Feralex-G (Shin et al. 2003), mais à l’heure actuelle aucun traitement ciblant l’aluminium dans la MA n’a été rapporté être en phase de tests cliniques. Cependant la recherche de chélateurs de l’aluminium ayant moins d’effet secondaire que DFOA est toujours d’actualité, ne serait-ce que pour les cas d’intoxication à ce métal (Missel et al. 2005).

Implication du Fer...

...avec Tau

Le fer semble jouer un rôle important dans la toxicité et l’agrégation de tau : la présence de fer dans les neurofilaments pourrait exercer une activité pro-oxydante (Sayre et al. 2000) et le fer (III) (mais pas le fer(II)) peut induire l’agrégation de tau hyperphosphorylé (agrégation réversible si le fer (III) est réduit en fer(II)) (Yamamoto et al. 2002).

L’homéostasie du fer est également liée indirectement à tau, via le bon fonctionnement des microtubules. En effet, il a été montré que les microtubules jouent un rôle important dans la régulation de le ferritine, une protéine de stockage du fer (Hasan et al. 2005). La ferritine a également été identifiée dans les filaments de tau dans le cas de paralysie supranucléaire progressive (ou maladie de Steele, Richardson et Olszewski) (Perez et al. 1998) et il semble que son dysfonctionnement dans la MA soit en partie responsable de l’augmentation du stress oxydant (Quintana et al. 2006).

… avec l’APP

Le fer semble réguler l’expression de l’APP, comme suggéré par des expériences utilisant le gène rapporteur codant la luciférase, accolé à la région 5' non traduite de l’ARNm de l’APP. La biosynthèse de l’APP est donc ainsi sous contrôle post-transcriptionnel « fer-dépendant », un taux élevé de fer intracellulaire augmente ainsi la production d’APP (Rogers et al. 2002; Venti et al. 2004; Reznichenko et al. 2006).

...avec Aβ

La concentration physiologique du fer ionique libre (Fe3+, Fe2+) est de l’ordre du pico- / nano- molaire. Or la constante de dissociation du fer(II) serait de l’ordre du micromolaire (la littérature étant très réduite dans ce domaine, cet ordre de grandeur reste à confirmer) (Garzon-Rodriguez et al. 1999), ce qui n’explique pas la présence massive de fer dans les plaques amyloïdes (Beauchemin and Kisilevsky 1998). Une dérégulation de l’homéostasie de ce métal pourrait donc en être l’origine. Il semble par exemple qu’un dysfonctionnement de la ferritine soit en partie à l’origine de l’accumulation de fer dans les plaques séniles, de plus elle a été retrouvée agrégée autour des plaques amyloïdes (Quintana et al. 2006).

...relativement à la toxicité

La littérature concernant le rôle du fer dans la MA est beaucoup moins importante que pour le cuivre et le zinc. Cependant il semble que, de la même manière que pour le cuivre, le peptide Aβ ait la capacité de catalyser la réduction de Fe3+ _{en Fe}2+ _{(éventuellement en présence}

d’agents réducteurs tels que l’ascorbate ou le gluthathion), favorisant ainsi la production de ROS (Smith et al. 1997; Huang et al. 1999). On peut envisager le mécanisme suivant, avec Meox-Aβ représentant Fe3+_{-Aβ ou Cu}2+_{-Aβ :}

Meox-Aβ + e- _{(agent réducteur)  Me}red_{-Aβ (1)}

Mered-Aβ + O2 ' Meox-Aβ + O2•- (2)

O2•- + O2•- + 2 H+  H2O2 + O2 (3)

Mered-Aβ + H2O2  Meox-Aβ + HO- + HO• (4)

La réaction (3) est catalysée par la superoxyde dismutase mais on peut aussi envisager la réaction suivante : Mered_{-Aβ + O}

2•- + 2 H+  Meox-Aβ + H2O2 (3’)

Concernant l’agrégation d’Aβ, la présence de fer ne semble ni promouvoir, ni retarder le processus (Yoshiike et al. 2001; House et al. 2004). Par contre, d’un point de vue structural, l’agrégation d’Aβ en présence de fer(III) conduit à des structures en feuillets bêta, il pourrait donc directement participer à la formation des plaques amyloïdes (House et al. 2004).

... en corrélation avec une approche thérapeutique

Le principal polyphénol contenu dans le thé vert, l’épigallocatechine-3-gallate, pourrait chélater le fer intracellulaire, diminuant ainsi la production de l’APP (l’étape post- traductionnelle étant dépendante du fer à cause de la luciférase) (Reznichenko et al. 2006). Des études ont également été menées avec la desferrioxamine (DFOA), utilisée depuis une quarantaine d’années dans le cas de surcharge en fer dans l’organisme (Chaston and Richardson 2003; Kalinowski and Richardson 2005). Cependant la DFOA, même si elle

donne de bons résultats in vitro (inhibition post-transcriptionnelle de l’APP) n’a pas la capacité de passer la barrière hémato-méningée. D’autres chélateurs du fer, capables de franchir la barrière hémato-méningée, sont donc à l’étude (Bandyopadhyay et al. 2006; Mandel et al. 2007). Ainsi un composé nommé M-30, qui active la différentiation neuronale, a un effet neuroprotecteur et permet la réduction du taux d’APP et d’Aβ, dans les cultures cellulaires (Avramovich-Tirosh et al. 2007).

Implication du cuivre…

...avec Tau

Le cuivre peut se lier à des peptides correspondant à la deuxième (R2) et troisième (R3) région répétitive d’accrochage aux microtubules de la protéine tau, induisant ainsi un changement conformationnel. Ce dernier correspond, pour le peptide R2, à la formation d’une structure en hélice alpha, ce qui pourrait favoriser la formation de filaments en paires d’hélices (Ma et al. 2005; Ma et al. 2006). D’autres études ont également avancé que la présence de cuivre dans les neurofilaments pourrait exercer une activité pro-oxydante (Sayre et al. 2000).

Il faut enfin noter que le cuivre perturbe la polymérisation des tubulines et donc l’assemblage en microtubules, ainsi une augmentation du taux en cuivre pourrait avoir des conséquences néfastes sur les neurones.

… avec l’APP

L’APP comporte un site de fixation du cuivre composé des ligands His-147, His-151, Tyr-168, Met-170 (Hesse et al. 1994; Atwood et al. 2000; Wegner 2000; Simons et al. 2002; Barnham et al. 2003). De plus, son expression semble réguler le taux de cuivre cytosolique (Davis et al. 2000; Armendariz et al. 2004; Bellingham et al. 2004) : la surexpression de l’APP induit une baisse du taux de cuivre cytosolique et inversement, en accord avec son rôle potentiel de transporteur du cuivre de l’intérieur vers l’extérieur de la cellule (White et al. 1999; Maynard et al. 2002; Bayer et al. 2003; Phinney et al. 2003; Bellingham et al. 2004).

Le cuivre pourrait également jouer un rôle dans la protéolyse de l’APP, en effet la β-sécrétase BACE1 peut lier un atome de cuivre dans son domaine C-terminal (via des résidus cystéines), or le domaine cytoplasmique de BACE1 interagit avec la protéine chaperon consacrée au cuivre de la superoxyde dismutase 1 (SOD1) et l’expression de BACE1 réduit l’activité de SOD1 (Angeletti et al. 2005; Dingwall 2007).

…sur la concentration d’Aβ

Paradoxalement, des études ont montré qu’un taux en cuivre élevé diminue la production d’Aβ, ce qui implique une régulation au niveau de la protéolyse de l’APP, la production de ce dernier étant sensée diminuer pour compenser l’élévation du taux de cuivre (Maynard et al. 2002; Bayer et al. 2003; Phinney et al. 2003). En effet le cuivre semble favoriser la voie non- amyloïdogénique puisqu’une augmentation de la concentration en fragments p3 non- amyloïdogéniques a été observée (Borchardt et al. 1999).

Cependant dans le cas d’un régime à haute teneur en cuivre et en cholestérol, on observe l’effet inverse, c’est-à-dire une augmentation de la production d’Aβ et l’apparition de plaques séniles (Sparks and Schreurs 2003). Ceci dénote la complexité de l’action du cuivre dans la MA et son caractère potentiellement pléiotropique (probablement dépendant de sa localisation extra- ou intracellulaire). De plus, suivant la technique utilisée pour révéler la présence de cuivre et en fonction de la localisation dans le cerveau (amygdale, néocortex ; tissus, plaques amyloïdes), les résultats peuvent parfois différer (Deibel et al. 1996; Loeffler et al. 1996; Lovell et al. 1998).

...avec Aβ

In vitro, il n’est pas clair si le cuivre accélère ou non l’agrégation du peptide Aβ, les deux types de résultats pouvant être trouvés dans la littérature (dépendant probablement du pH, tampon et de la technique de détection) (Atwood et al. 1998; Zou et al. 2001; Raman et al. 2005; Ha et al. 2007). Cependant, certaines études indiquent que les agrégats formés en présence de cuivre sont majoritairement amorphes et ne contiendraient donc peu ou pas de fibres (Exley 2004).

Le site de fixation du cuivre, de géométrie plan carrée, est vraisemblablement constitué d’au moins 3 azotes provenant du cycle imidazole des histidines 6, 13 et 14 (Curtain et al. 2001; Schoneich and Williams 2002; Kowalik-Jankowska et al. 2003; Lim and Vachet 2003; Kowalik-Jankowska et al. 2004; Syme et al. 2004; Karr et al. 2005; Guilloreau et al. 2007). Le 4ème ligand n’a pas encore été clairement identifié et serait dépendant du pH : oxygène à bas pH, azote à haut pH (hétérogène à pH physiologique) (Kowalik-Jankowska et al. 2003; Syme et al. 2004; Guilloreau et al. 2007). Ainsi, en fonction des conditions expérimentales, différents ligands ont été proposés : N-terminal, carboxylate de l’aspartate 1 ou du Glutamate 11, azote du squelette carboné (Kowalik-Jankowska et al. 2003; Syme et al. 2004; Karr et al. 2005; Hou and Zagorski 2006). Un équilibre entre le N-term et l’oxygène de l’aspartate 1 est très probable (spectre de dichroïsme circlaire modifié quand le peptide est acétylé, perte du

ligand oxygène par délétion des trois premiers acides aminés, effet paramagnétique important sur Asp1 en RMN du proton). La présence ainsi que l’absence d’effet de l’eau marquée ont été rapportés, ce qui ne permet pas de statuer sur la présence de ligand H2O axial labile, qui

dépend probablement des conditions expérimentales (Karr et al. 2005; Guilloreau et al. 2007). Bush et al. ont montré qu’Aβ (et ses formes tronquées) était capable de fixer 2 équivalents de cuivre(II) avec des constantes de dissociation différentes, faisant ainsi apparaître un site de forte affinité et un site de fixation plus faible. Garzon-Rodriguez et al. ont mesuré les constantes d’affinité du cuivre(II) pour le peptide Aβ40 et 42 sur le site de plus forte affinité en suivant la fluorescence due à la Tyrosine (en position 10) (Garzon-Rodriguez et al. 1999). Les expériences ont révélé des constantes de dissociation de l’ordre de 2μM dans le tampon Tris. Des expériences similaires, dans le même tampon, ont été menées par Karr et al., révélant des constantes de dissociation de 11 ; 28 ; 47 μM respectivement pour les peptides Aβ40, Aβ28 et Aβ16 (Karr et al. 2005). Cependant ces constantes sont des constantes apparentes car les expériences ont été réalisées dans un tampon qui lui aussi possède une affinité pour le cuivre. Il y a donc compétition entre le tampon et le peptide. Pour s’affranchir de ce paramètre, Syme et al. ont effectué des mesures par compétition avec deux ligands du cuivre (Histidine et Glycine) (Syme et al. 2004). Ils ont ainsi encadré le Kd de l’Aβ28 entre 1,5 et 500 nM. Si on tient compte du tampon utilisé (et de son affinité pour le cuivre), les Kd sont similaires. Le peptide Aβ soluble et les peptides modèles plus courts présentent à pH physiologique un Kd apparent de l’ordre du nanomolaire. Les dernières études réalisées par calorimétrie de titrage isotherme et différentes méthodes spectroscopiques confirment ces valeurs : Kd apparent de l’ordre 100 nM dans l’Hepes à pH 7,4 (10 μM pour le site de faible affinité) (Guilloreau et al. 2006).

...relativement à la toxicité

D’un point de vue de l’agrégation, des études in vivo, ont montré une augmentation de plaques séniles liée à un déclin cognitif, lors d’un régime riche en cuivre et cholestérol (Sparks et al. 2003; Morris et al. 2006). De plus, l’administration de clioquinol à des souris transgéniques induit une diminution des plaques amyloïdes de près de 50% (Cherny et al. 2001). In vitro, à pH 7,4, des traces de cuivre(II) (concentration inférieure à 0,1 μM) suffisent à induire la précipitation du peptide (Atwood et al. 2000). Ce phénomène est amplifié à pH acide (pH = 6,6), ce qui est également le cas de fer(III) (Atwood et al. 1998). Or le pH au sein du cerveau d’un patient atteint de la MA a tendance à s’acidifier légèrement suite à un phénomène d’inflammation, favorisant ainsi la précipitation d’Aβ par le cuivre et le fer.

d’Aβ pour les neurones (Bush et al. 2003). De nombreuses études ont montré qu’Aβ est toxique in vitro et in vivo en relation avec la présence d’ions métalliques redox actifs trouvés associés aux lésions amyloïdes dans des cerveaux post-mortem (Smith et al. 1997; Sayre et al. 2000; Tabner et al. 2002; Cuajungco et al. 2005). La présence de peptide Aβ oxydé sur la méthionine 35, retrouvé associé aux métaux cuivre(II) et zinc(II) dans les plaques amyloïdes

post mortem, traduit également un environnement pro-oxydant au niveau de ces plaques

(Dong et al. 2003). En effet, le peptide Aβ (en particulier les formes longues), en présence d’ions métalliques FeIII ou CuII et de réducteurs biologiques extérieurs tels que l’ascorbate, la dopamine ou le cholestérol, est capable de générer du peroxyde d’hydrogène H2O2 (Huang et

al. 1999a; Opazo et al. 2002). Une récente étude a confirmé que le peptide Aβ42 était le plus toxique vis-à-vis de la production de ROS (produisant notamment 5 fois plus de HO• que Aβ40), tout en indiquant que la quantité de HO• générée par les complexes CuII-Aβ était modéré (se situant entre celles de CuII_{-GHK et Cu}II_{-DAHK, 2 complexes physiologiques)}

(Guilloreau et al. 2007).

Implication du zinc…

...avec Tau

Plusieurs des kinases phosphorylant tau (notamment p70 S6) peuvent être activées par le zinc (Harris et al. 2004; Bjorkdahl et al. 2005; Pei et al. 2006). Or il a été montré que le taux de zinc dans le néocortex augmentait significativement chez la personne atteinte de la MA (Danscher et al. 1997; Lovell et al. 1998; Opazo et al. 2006), ce qui pourrait favoriser l’hyperphosphorylation de tau.

Plus généralement, le zinc (ainsi que le magnésium) est également impliqué dans la polymérisation des tubulines, en effet une carence alimentaire maternelle en zinc peut altérer le développement du cerveau du fait de perturbations dans la formation des microtubules (Gaskin and Kress 1977; Oteiza et al. 1990; Oteiza et al. 1990; Yoshiike et al. 2001).

… avec l’APP

L’APP comprend un site de fixation du zinc (Bush et al. 1993; Bush et al. 1994; Bush et al. 1994). Il est compris dans la région 170-188 de la protéine et est constitué de deux résidus cystéines 186 et 187 et d’autres ligands potentiels (Cys-174, Met-170, Asp-177, Glu-184). La fixation de zinc pourrait favoriser la formation d’un dimère in vivo (Scheuermann et al. 2001; Ciuculescu et al. 2005).

d’Aβ. Tout d’abord le domaine de fixation du zinc dans la région Aβ de l’APP s’étend sur le domaine de clivage de l’α-sécrétase, le métal pourrait donc potentiellement moduler le clivage ainsi que la dégradation du peptide (Hoke et al. 2005). Ensuite, la préséniline, une sous-unité de la γ-sécrétase, est également sensible au taux de zinc (la production de PS1 augmentant avec l’administration exogène de zinc) (Park et al. 2001).

Une des α-sécrétases potentielles, la TACE, possède un ion zinc dans son domaine catalytique. La liaison cystéine–zinc régule (parmi d’autres interactions) l’activité catalytique de la sécrétase (Cross et al. 2002; Gonzales et al. 2004; Buckley et al. 2005). Similairement, ADAM-10, une autre candidate pour le clivage en α de l’APP, possède également un site de fixation du zinc indispensable à son activité catalytique (Lammich et al. 1999).

…sur la concentration d’Aβ

Environ 15 % du zinc cérébral est stocké sous forme ionique dans des vésicules pour être ensuite transitoirement libéré dans la synapse. Des études ont montré que le zinc synaptique des fibres moussues de l’hippocampe semble avoir un effet important sur la production d’Aβ, en effet, une ablation du gène codant pour la protéine transportant le zinc dans les vésicules synaptiques (ZnT3) induit une importante réduction des plaques amyloïdes chez les souris transgéniques surexprimant l’APP (Lee et al. 2002).

...avec Aβ

La présence de zinc induit la précipitation du peptide dans une large gamme de pH (5,5-7,5) (Bush et al. 1994; Cherny et al. 1999; Yoshiike et al. 2001). Mais la nature fibrillaire des agrégats induits par le zinc est controversée (Exley 2006; Ha et al. 2007). Le mécanisme d’agrégation d’Aβ en présence de zinc sera l’objet des chapitres 3 et 4 de cette thèse.

La fixation du zinc à Aβ correspond, d’après la littérature, à un Kd apparent de l’ordre du micromolaire (pour plus de détails, se reporter à la partie introduction du chapitre 2) (Clements et al. 1996; Mekmouche et al. 2005), le peptide fixe donc moins bien le zinc que le cuivre. De plus, comme pour le fer, les concentrations en zinc libre sont généralement trop faibles pour permettre à Aβ de se lier au métal et l’affinité du zinc pour les protéines à zinc du