Matériels et méthodes

II.2.1. Echantillonnage et aires de culture

Les échantillons ont été prélevés à partir de différentes parcelles de pois chiche (Cicer

arietinum L.) cultivées des les wilayas de Sidi Belabbas, Rélizane, Ain Témouchent, Mascara,

Blida, Constantine, Skikda et Sétif. La collection d’échantillon effectuée entre 2013 et 2015, consistent à des prélèvements de sol à une profondeur de 10 à 15cm englobant la rhizosphère de la culture de pois chiche. Les échantillons sont ensachés, numérotés et conservés à 4°C au niveau du laboratoire en vu d’être analysés ultérieurement.

II.2.2. Isolement et purification de l’agent pathogène (FOC)

La technique d’isolement utilisée est celle décrite par Rapilly, (1968). Elle consiste à préparer des petits fragments de tiges et de racines d’environ 0.6 cm à partir des plantes infectées. Les fragments sont ensuite désinfectés soit à l’aide d’hypochlorite de sodium 80%, soit à l’aide d’alcool à 95% pendant 3minutes, puis rincés trois fois avec de l’eau distillée stérile. Après un séchage entre deux papiers filtres stériles, les fragments de tiges, de racines et de collets sont déposés dans des boites de pétri contenant du milieu PDA gélosé à raison de six fragments par boite. Les boites sont ensuite incubées à l’obscurité et à 25°C pendant cinq à six jours jusqu’au développement de colonies fongiques (Leslie, Summerell, 2006).

Les colonies fongiques obtenues et identifiées selon leur aspect macroscopique sont conservées à 4°C dans des tubes à essai contenant du milieu PDA incliné, afin de constituer une collection d’isolats qui devrait servir aux études ultérieures.

II.2.3. Identification des isolats de Fusarium oxysporum fs. ciceris II.2.3.1 Caractérisation macroscopique

Les caractéristiques macroscopiques sont relevées visuellement à l’œil nu. Elles concernent surtout, la vitesse de croissance, l’aspect du mycélium, la couleur du mycélium du deux cotés de la boite de Pétri (recto et verso) et la diffusion ou non des pigments dans le milieu. Le milieu PDA a été utilisé pour la recherche des caractères morphologiques des isolats. C’est un milieu qui est communément utilisé pour caractériser les espèces du genre

Chapitre II Etude du pouvoir antagoniste antifongique des rhizobactéries in Vitro

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II.2.3.2 Caractérisation microscopique

L’observation du pathogène au microscope permet l’identification des champignons en se basant sur les caractères morphologiques des spores. Cet examen est réalisé en déposant un fragment d’une colonie entre une lame et une lamelle, dans une goutte de bleu coton ou dans du lactophénol (colorant spécifique des champignons) (Anonyme, 2008).

II.2.4. Effets des facteurs physicochimiques sur la croissance des isolats du FOC

Il s’agit d’une série de tests, permettant de mettre en évidence l’influence des facteurs physicochimiques tels que les milieux de culture, le pH du milieu, la température et la lumière sur la croissance et la sporulation des souches fongiques.

II.2.4.1. Effet du milieu de culture sur la croissance mycélienne et la sporulation

Les deux milieux les plus utilisés dans la croissance mycélienne des Fusarium ont été testés à savoir le PDA et le SNA. L’objectif est de déterminer le milieu de culture le plus approprié à la croissance mycélienne et la production des spores pour nos isolats fongiques.

La mise en culture s’est effectué par dépôt au centre de la boite de pétri d’une bouture mycélienne de 5mm de diamètre, prélevée de l’extrémité marginale d’une culture âgée de 7 jours. La croissance mycélienne est mesurée aux troisième et septième jours d’incubation par la mesure des deux diamètres perpendiculaires (Blaise et al, 2001). En plus, la sporulation a été déterminée par comptage à la cellule de Malassez après les mêmes périodes d’incubation que précédemment. On note que pour chaque test deux boites de Pétri on été utilisé en guise de répétitions et la moyenne a été calculée à chaque fois pour les quatre isolats étudiés.

II.2.4.2. Effet de la température sur la croissance mycélienne

La température influence la croissance mycélienne des champignons ainsi que leur métabolisme. En plus, elle a une action sur la vitesse des réactions chimiques et biochimiques (Castellanos et al. (2000). Pour étudier ce paramètre chez les quatre isolats du FOC, les cultures mycéliennes ont été incubées à différentes températures allant de 5°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C jusqu’à 35° pour une durée d’une semaine de culture. Comme précédemment, deux boites de Pétri on été utilisé en guise de répétitions et la moyenne a été calculée à chaque fois pour les quatre isolats étudiés.

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II.2.4.3. Effet du pH du milieu sur la croissance mycélienne

Dans le but d’apprécier l’action du pH sur la croissance de quarte isolats du FOC, nous avons ajusté le pH du PDA à différents degrés allant de 5 à 8. Cette gamme tamponnée permet d’éviter toute variation lors de la dégradation des éléments nutritifs par le champignon. Le pH est contrôlé à l’aide d’un pH-mètre pour une éventuelle correction. En effet, des disques de 5mm ont été déposés au centre des boites de Pétri et incubées à la température de 25°C et à l’obscurité. L’action de pH est évaluée par la mesure des deux diamètres perpendiculaires(Castellanos et al. (2000).

II.2.4.4. Effet de la lumière sur la croissance mycélienne et la sporulation

La durée d’éclairage joue un rôle important dans le développement des champignons. L’étude de l’impact de ce paramètre sur la croissance de nos isolats a été réalisée en deux conditions de lumière. La première consiste à incuber les boites de Pétri contenant des cultures mycéliennes à l’obscurité totale (24h/24h) alors que la deuxième consiste à alterner une photopériode de 12h avec une durée de 12 à l’obscurité (Waite et Stover 1960 ; El Aoufir, 2001). Après une durée d’une semaine d’incubation les dimensions des colonies et le nombre de spore ont été déterminés.

II.2.5. Etude de l’activité antagoniste in vitro

II.2.5.1. Inhibition de la croissance mycélienne in vitro

L’inhibition de la croissance mycélienne du FOC a été estimée en suivant la méthode de Vincent et al. (1991). Cette dernière consiste a inoculée en stries la moitié de la boite de Pétri avec 20μl de la suspension bactérienne, puis incubée à 28°C pendant 48 heures. Par la suite, un disque de 5mm de diamètre d’une colonie fongique du FOC est prélevé à partir d’une culture fraiche de 7 jours à l’aide de l’emporte-pièce puis placée dans l’autre moitié de la boîte contenant le milieu PDA avec une distance éloignée de 3cm des stries bactériennes (figure 5). Les boites sont incubées pendant 7 jours à 28°C, l’expérience à été répétée 3 fois.

Le diamètre de la croissance mycélienne du champignon a été mesuré après le 4ème et 7éme jours et comparé à la croissance du témoin où la suspension bactérienne a été remplacée par le bouillon nutritif stérile. Le taux d'inhibition a été calculé en selon la formule suivante :

Croissance fongique

% inhibition de croissance = x 100 Croissance du témoin

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38 Figure 5: Inhibition du champignon par les produits diffusibles selon Vincent et al. (1991).

II.2.5.2. Etude de l’antagonisme par les composés volatiles

Une quantité de 100ml de la suspension bactérienne 5x109 CFU/ml était placée au centre de boite de pétri contenant le milieu GN et un disque de 10mm d’une culture pure de 4jours du FOC a été placée au centre d’une boite de pétri contenant le PDA. Les deux boites ont été placés face à face empêchant tout contact physique entre le FOC et la bactérie antagoniste et elles ont été scellées pour isoler l’atmosphère intérieure afin d’empêcher la perte des composés volatiles produits. Les boites ont été incubés à 28°C pour cinq jours et la croissance mycélienne du FOC a été mesurée et à la croissance mycélienne du même champignon en absence de la bactérie antagoniste. Le test a été répété Chaque isolat bactérien a été testé trois fois et à chaque fois trois boites de pétri ont été utilisées. Les résultats sont exprimés en tant que moyennes des pourcentages d’inhibition +S.D. de la croissance de FOC en présence et absence de tout isolat bactérien (Fiddaman and Rossall, 1993).