Matériel et méthodes

IV.2.1. Isolement et purification des rhizobactéries

Au total soixante- deuze (72) souches de Pseudomonas ont été isolées à partir de la rhizosphère des plantes après avoir subis une secousse douce afin de libérer le sol qui adhère aux racines. En effet, un gramme de sol de chaque échantillon a été homogénéisé avec 10ml d’eau distillée afin de constituer les solutions mères. Par la suite une série de dilutions décimales a été obtenue, elle consiste à prélever 1ml de la solution qui précède et le mélanger avec 9ml d’eau distillée stérile pour constituer la solution qui suit et ainsi de suite jusqu’à l’obtention de la dilution 10-5

. Une fois les dilutions préparées, et en vue d'isoler les bactéries recherchées que contient l’échantillon, 1ml de chaque dilution a été étalé sur des boites de pétri de 9mm contenant le milieu King B (King et al, 1954). Les boites de Pétri sont alors incubées à 28±2°C pour une durée de 48h dans étuve bactériologique de la marque Memmert.

Les colonies de souches bactériennes pures fluorescentes apparues, sont repiquées dans des tubes contenant le milieu KB additionné de 25% de glycérol et incubées dans les mêmes conditions que précédemment. La conservation se fait à une température de -20°C, avec un repiquage tout les 6 mois pour le renouvellement des souches.

Pour l’isolement des Bacillus, le protocole Travers et al. (1987) avec une légère modification a été adopté. La méthode consiste à peser 1g de sol de chaque échantillon et l’homogénéiser dans 10 ml d'eau distillée stérile. La solution obtenue est soumise à un traitement thermique à la température de 65°C pendant 30mn et des séries de dilutions décimales ont été préparées comme décrit précédemment, une quantité de 0.1ml de chaque dilution a été étalée sur une boite de pétri contenant la gélose nutritive. Les boites de Pétri sont alors incubées à 28±2°C pour une durée de 48h dans étuve bactériologique Memmert.

Les souches de Bacillus purifiées sont identifiées grâce à la réaction de gram et la présence d'endospore. Les tubes sont ensemencés et incubés à la température de 28°C pendant une durée de 24h à l’étuve de marque Memmert. Les tubes qui ont montré une croissance bactérienne on été conservés à 4°C pour une durée de 4 à 6 semaines dans des tubes inclinés contenant le milieu GN (Gélose nutritif), (Marchel et al, 1982).

IV.2.2. Identification des rhizobactéries

IV.2.2.1. Etude des caractères morphologiques

L’aspect macroscopique des colonies permet d’effectuer une première caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de l’identification (Prescott’s, 2002).

Chapitre IV Identification et caractérisation des rhizobactéries antagonistes

97 La caractérisation morphologique des souches a été basée sur des observations macroscopiques afin de définir l’aspect des colonies bactériennes alors que l’observation sous microscope optique (grossissement x100) permet la différenciation des caractères morphologiques : forme des bacilles, type de Gram, coques et disposition des cellules.

IV.2.2.2. Aspect microscopique

On peut observer les bactéries par deux techniques, soit à l’état frais ce qui permet de déterminer la forme, l’arrangement et la mobilité des bactéries, soit la coloration de Gram et la coloration de spores, qui permet de mettre en évidence les spores et leur position sur les cellules bactériennes). En effet, la coloration de gram a été effectué où deux gouttes d’une solution d’hydroxyde de potassium (KOH 3%) sont mises en contact avec une crème bactérienne sur une lame en effectuant un mouvement circulaire. La solution KOH devient visqueuse en présence des bactéries à gram négatifs. La réaction est considérée positive si la viscosité est obtenue après 30s (Bourgault et Lamothe, 1988).

IV.2.3. Détermination des types et enzymes respiratoires

C’est un test qui concerne les espèces du genre Bacillus. Il permet la différenciation des souches qui poussent en milieu aérobiose et celles qui vivent en anaérobiose.

Le test de culture en aérobiose est réalisé en présence de l’oxygène atmosphérique, lorsqu’on observe une croissance après 24 heures à 30°C, cela signifie que la bactérie est aérobie. Et elle définie bactérie anaérobie si elle arrive à croitre après 24 heures à 30°C dans une culture en anaérobiose partielle avec une atmosphère enrichie en CO2 (Prescott’s, 2002).

IV.2.4. Production des enzymes respiratoires terminales IV.2.4.1. Recherche de l’oxydase

Ce test, standardisé pour l’identification bactériologique (Prescott, 2007). Le test de l'oxydase met en évidence la présence d'une cytochrome-oxydase qui oxyde le cytochrome c réduit. Ce test met en évidence la présence de cytochrome c dans les chaînes respiratoires grâce à des réactifs ayant le même potentiel d'oxydo-réduction que le cytochrome c. L’oxydase a été mise en évidence sur papier filtre selon la technique de Kovacs (1956), où une colonie est étalée sur un disque imprégné de Diméthyl-p-phénylène diamine préalablement trempé dans de l’eau distillée stérile.

Chapitre IV Identification et caractérisation des rhizobactéries antagonistes

98 La réaction positive se traduit par l’apparition d’une couleur rouge violacée au bout de 10 secondes (s); elle est considérée tardive si elle se développe entre 10 et 60s, dépassée la durée de 60s, elle est considérée négative.

IV.2.4.2. Recherche de la catalase

En présence d'oxygène moléculaire, certaines réactions métaboliques conduisent à la formation d'eau oxygénée. La catalase est une enzyme qui dégrade l'eau oxygénée en eau et oxygène. C’est une enzyme présente chez la plupart des bactéries aérobies et anaérobies facultatives contenant un cytochrome, la catalase décompose le H2O2. La mise en évidence

de la catalase se pratique par l’ajout d’une goutte de H2O2 à volume 10 et Prélever à l'aide de

l'effilure d'une pipette pasteur un fragment de colonie et dissocier la culture dans l'eau oxygénée. y dissocier une colonie prélevée à l’aide d’une anse platine. Le dégagement d’O2

sous forme de bulles de gaz est synonyme que la bactérie a produit de la catalase e ainsi elle est considérée comme catalase positive (Talaro et Talaro, 2002).

IV.2.4.3. Recherche de la gélatinase

La production de la gélatinase est mise en évidence à travers l’ensemencement par piqure centrale de la souche bactérienne dans des tubes à essais contenant la gélatine comme milieu nutritif. Les tubes sont incubés à 30°C pendant une durée de 24 - 48h. L’étape suivante, consiste à placer les tubes de gélatine nutritive dans un réfrigérateur à 4°C pendant 30 minutes ou dans un bain de glace pendant 3 à 5 minutes. Si la gélatine nutritive est présente sous forme liquide, ceci indique que la gélatine a été hydrolysée par la bactérie. En revanche, si aucune hydrolyse ne se produisait, le milieu demeurera un gel (Matter, 2001).