NCLs non chargées (n=6) 48.8 ± 1.0 0.07 ± 0.01 NA NA NCLs chargées (n=3) 47.2 ± 0.7 0.08 ± 0.01 8.42 ± 1.05 80 ± 9
4.3.3.1 Evaluation de la cytotoxicité et de la cinétique de libération des NCLs
chargées de P-IFO
Une fois l’optimisation de la formulation des NCLs (chargées ou non) terminée par l’unité de « micro et nanomedecines translationnelles» (MINT, U1066) de l’Université d’Angers, nous avons pu effectuer l’évaluation de leur cytotoxicité sur deux lignées cellulaires cancéreuses, suivie de l’étude de la cinétique de libération du P-IFO à partir des NCLs au sein l’UMR8203.
Matériel et méthodes
4.3.4.1 Réactifs et produits
L’hydroxy-ifosfamide (HO-IFO) a été obtenu par réduction de l’hydroperoxy-ifosfamide (HOO-IFO) commercialisé par Niomech (Bielefeld, Germany) avec une pureté de 99%. Le pentanyloxy-ifosfamide (P-IFO) et le 13,17-dimethyloctanyloxypentanyloxy-ifosfamide (DMO-IFO) ont été synthétisés avec une pureté de 99% au sein de l’institut de chimie des matériaux Paris Est [416], leurs structures ont été déterminées par RMN 31P, 1H and13C et leur pureté par spectrométrie de masse haute résolution. L’hydrochlorure de semicarbazide, (SCZ), l’héxaméthylphosphoramide (HMP), le tert-butyl méthyl éther (MTBE), l’acétonitrile LC-MS grade, le polysorbate 80 (Tween 80®) et les membranes de dialyse (Spectra-Por® Float-A-Lyzer® 100kDa) ont été fournis par Sigma–Aldrich (St Louis, MO, USA). Pour la culture cellulaire, les milieux Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM), Roswell Park memorial institute medium (RPMI), le sérum de veau fœtal et les antibiotiques (pénicilline, streptomycine) ont été fournis par Gibco (Paisley, UK). Le réactif MTS ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)) a été fourni par Promega (Charbonnières-les-Bains, France). Enfin, les NCLs non chargées et chargées ont été réalisées par l’unité de micro et nanomédecine Translationnelle (MINT) de l’Université d’Angers ( Dr E. Roger).
4.3.4.2 Lignées cellulaires
Les modèles cellulaires utilisés pour cette étude sont les lignées A673 (sarcome d’Ewing) et RMS-1 (Rhabdomyosarcome). Ces cellules ont été sélectionnées car elles correspondent aux lignées sur lesquelles nous avons fait nos études préliminaires. Elles sont sensibles à l’IFO et sont utilisées en
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routine au sein de notre équipe lors des essais in vitro. Les cellules sont cultivées à 37 °C en présence de 5 % de CO2 et avec une hygrométrie de 95%. Les milieux utilisés sont les milieux DMEM ou RPMI additionnés de 10 % de sérum de veau fœtale et 1 % d’antibiotiques (100 U/mL pénicilline et 100 µg/mL streptomycine).
4.3.4.3 Etude de viabilité cellulaire in vitro
L’activité cytotoxique des composés P-IFO (sous la forme libres et encapsulé dans les NCLs) et des NCLs non chargées a été étudiée à l’aide de la méthode MTS permettant la détermination de la viabilité cellulaire. Les cellules sont ensemencées dans des plaques 96 puits par addition de 100 L de cellules à une concentration de 5.103 cellules /mL, les plaques sont ensuite incubées à 37°C en présence de 5% de CO2 et une hygrométrie de 95%. Après une nuit d’incubation, les cellules sont traitées par addition de 100 L du produit à étudier (P-IFO sous la forme libre, NCLs chargées en P-IFO ou NCLs non chargées) à différentes concentrations (0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 200 M de p-IFO, les NCLs non chargées sont ajouté aux mêmes dilutions que les NCLs de P-IFO). Après 72 h d’incubation, 20 L (1/10) du réactif MTS sont ajoutés dans chaque puits. Selon la lignée cellulaire étudiée, un temps d’incubation de 2 à 5 h est nécessaire afin d’obtenir une densité optique optimale ensuite mesurée à la longueur d’onde de 490 nm (longueur d’onde du formazan, molécule libérée lors de réduction du MTS par les cellules). Les cellules non-traitées sont utilisées comme témoin négatif. Chaque concentration est testée en sixplicata (n=6). La concentration inhibant 50% de la prolifération cellulaire (IC50) est ensuite déterminée graphiquement à l’aide du logiciel Prism 5™ (Graph Pad Software Inc, San Diego, CA, USA).
4.3.4.4 Mise en place de la cinétique de libération
L’étude de la cinétique de libération du P-IFO encapsulé dans les NCLs a été effectuée après dépôt des NCLs dans un boudin de dialyse lui-même introduit dans un milieu de réception. Brièvement, 600 L de NCLs chargées ont été introduits dans un boudin de dialyse celui-ci est ensuite introduit dans 250 mL de PBS 1X, de Tween 80 pure et d’une solution de semicarbazide à 2M (89/1/10 ; v/v/v). L’ensemble étant maintenu à 37°C et sous légère agitation tout au long de l’étude. Aux différents temps étudiés lors de la cinétique (0 ; 0,5 ; 1 ; 2 ; 3 ; 4 ; 6 et 24 h), une prise d’essai de 100 L est prélevée au sein du milieu de réception et remplacée par le même volume de milieu frais. De plus, une prise d’essais de 20 L de la suspension de NCLs est prélevée au temps T = 0 et à T24 h, afin de déterminer la concentration initiale. Cette cinétique a été effectuée en duplicata, sur deux suspensions de NCLs (n=2) indépendantes. Les prises d’essais ont été extraites avec 1 mL de tert-butyl méthyl éther (TBME) après addition de 200 L d’étalon interne (300ng/mL du mélange HMP/DMO). Après homogénéisation au vortex et centrifugation 30 s à 10 000 rpm, un volume de
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950 L de surnageant est prélevé été évaporé puis le résidu obtenu a été repris dans la phase mobile. La quantification des produits a ensuite été effectuée selon la méthode LC-MS/MS développée par notre équipe [413]. Brièvement, les analyse ont été menées sur un système LC-MS/MS composé d’une chaîne HPLC 1100 séries (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) contenant une colonne de type Uptisphere® C18 (100 mm × 2.1 mm i.d., taille de particule 5 µm) (Interchim, Montluçon, France). La séparation a été effectuée en mode isocratique à un débit de 0.25 mL/min à l’aide d’une phase mobile composée d’ACN et d’un tampon d’acétate d’ammonium à une concentration de 10 mM (pH=5.5) (95/5, v/v). Le temps d’analyse permettant la séparation de l’ensemble des composés a été de 3.5 min. Avant chaque échantillon, l’auto sampler a été rincé à l’aide d’une injection d’ACN. La détection de chaque composé a été menée à l’aide d’un spectromètre de masse triple quadripôle QuattroLC® (Waters, Manchester, UK) opérant en mode electrospray positif en utilisant les transitions MRM suivantes : m/z 347 → 259 pour le P-IFO et m/z 334 → 221 pour le SCZ-O-IFO (correspondant au HO-IFO dérivé) 180 → 135 pour HMP (Etalon Interne1), 347 → 259 pour le DMO-IFO (Etalon Interne2). Les analyses ont été menées avec un temps Dwell de 0.2ms, l’énergie de collision a été optimisée selon le composé, la tension de cône et du capillaire a été réglée à 25 et 3500 V. Enfin, la température de la source et du gaz de désolvatation a été réglée à 90 et 250 °C, le gaz de collision (Ar) a été réglé à 1.2 10-3 mbar. Les données ont ensuite été analysées à l’aide du logiciel Masslynx™.
Résultats
4.3.5.1 Etude de viabilité cellulaire in vitro
L’évaluation de l’activité cytotoxique du P-IFO (sous la forme libre et sous la forme de NCLs) ainsi que des NCLs non chargées a été effectuée par détermination graphique de leurs IC50
(concentration inhibant 50 % de la croissance cellulaire) à partir de leurs courbes de survie respectives (Figure 34). A) 0 .1 1 1 0 1 0 0 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 I C5 0= 1 6 . 6 ± 3 .3 µ M I C5 0= 1 4 . 5 ± 2 .1 µ M I C5 0 =6 7 .0 ± 2 .0 µ M C o n c e n t r a t i o n s ( µ M ) v ia b il it é c e ll u la ir e ( % ) B) 0 .1 1 1 0 1 0 0 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 I C5 0= 5 . 1 ± 1 . 9 µ M I C5 0= 9 . 5 ± 2 . 1 µ M I C5 0= 2 3 . 4 ± 6 .1 µ M C o n c e n t r a t i o n s ( µ M ) v ia b il it é c e ll u la ir e ( % )
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Figure 34 : Courbes de survie du P-IFO sous la forme libre (●), encapsulé dans les NCLs (■) ou des NCL non chargées (▲) sur les lignées A673 (A) ou RMS-1 (B) après 72h d’incubation
Lors de l’évaluation de l’activité cytotoxique des dérivés préactivés de l’IFO, nous avons établis qu’un produit est considéré comme active quand sa valeur d’IC50 est inférieur à 50 µM. Une IC50 de 16.6 ± 3.3 µM et 5.1 ± 1.9 µM a été obtenue sur les lignées A673 et RMS-1, respectivement pour le P-IFO sous sa forme libre. Pour la formulation du P-P-IFO sous la forme de NCLs des valeurs IC50
de 14.5 ± 2.1 µM et 9.5 ± 2.1 ont étéobtenues sur les lignées A673 et RMS-1, respectivement. Les NCLs non chargées, quant à elles n’ont montrées aucune activité sur la lignée A673 (67.0± 2.0 µM), mais une IC50 de 23.4± 6.1 µM sur la lignée RMS-1 témoin d’une activité cytotoxique. Sur la lignée A673, aucune différence significative de cytotoxicité a été observée entre la forme libre et la forme NCLs. En revanche, sur la lignée RMS-1, les NCLs ont montré une diminution de l’activité avec une IC50 divisée par un facteur 2 avec des valeurs d’IC50 différentes entre les formulations libres et NCLs. Concernant l’évaluation des NCLs non chargées, nous n’avons observé aucune activité cytotoxique sur la lignée A673 au vu de sa valeur d’IC50 de 67.0± 2.0 µM, cependant cette formulation présente une cytotoxicité relative sur la lignée RMS-1 avec une valeur d’IC50= 23.4 ± 6.1 µM.
4.3.5.2 Etude de libération du P-IFO à partir des NCLs
La quantification du p-IFO et OH-IDFO dans les suspensions de NCLs utilisées pour cette étude (F1 et F2) au temps T0 a montré la présence du composé HO-IFO synonyme de dégradation du P-IFO, celle-ci ayant été évaluée à environ 50% (Tableau 7).
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Tableau 7 : Quantification des composés P-IFO et HO-IFO contenu dans les suspensions de NCLs au temps T=0
Concentration molaire Concentration théorique
(mg/mL)
P-IFO HO-IFO Total P-IFO
F1 F2 F1 F2 F1 F2 F1 F2
12,4 12,2 11,8 10,4 24,2 22,6 8,4 7,8
Les concentrations quantifiées de P-IFO et HO-IFO ont été normalisées et exprimées en pourcentage par rapport à leurs concentrations initiales au temps T0 (Figure 35)
0 6 1 2 1 8 2 4 3 0 0 2 0 4 0 6 0 t e m p s ( h ) P o u r c e n ta g e à p a r ti r d e T 0 ( % ) P - IF O H O - IF O
Figure 35 : Cinétique de libération du P-IFO et du HO-IFO à partir des NCLs chargées (n=2)
Ces résultats montrent une libération rapide du HO-IFO. Cette libération rapide est expliquée par la présence d’HO-IFO dans la suspension de NCLs de départ. Concernant la cinétique de libération du P-IFO, nous observons une libération progressive au cours du temps. De plus, une diminution de la quantité de P-IFO et HO-IFO au point tardif de 24 heures est observée, cette diminution peut être expliquée par une transformation en entités non quantifiées.
Discussion
Les travaux de formulation entrepris au sein de l’unité de « micro et nanomedecines translationnelles » (MINT, U1066) de l’Université d’Angers ont donné lieu à la mise au point d’une formulation optimisée permettant l’encapsulation du P-IFO au sein de NCLs. L’évaluation de la cytotoxicité de ces NCLs a montré une activité de celle-ci sur deux lignées cellulaires sensibles à l’IFO. Ces activités qui sont de l’ordre de 20 µM son semblable à celle obtenues avec le HO-IFO sur ces mêmes lignées cellulaires (résultats non présentés). Cependant une activité de l’ordre de 20 µM a été observée sur la lignée RMS-1 dans le cas des NCLs non chargées. Cette toxicité correspondant à une suspension de NCLs non chargées diluées à 0.16% dans le milieu et peut être imputé aux constituants rentrants dans la composition des NCLs. Les résultats de l’évaluation de
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l’activité cytotoxique des NCLs chargées en P-IFO permettent de confirmer l’activité du composé après encapsulation au sein des NCLs.
Concernant la cinétique de libération du P-IFO à partir des NCLs, celle-ci est progressive dans le temps avec une cinétique de libération prolongée et graduelle dans le temps. Ces résultats sont cohérents avec la littérature et nos attentes et montre bien l’effet bénéfique de l’encapsulation de composés d’intérêt au sein de NCLs [415, 430]. Néanmoins, lors de cette étude, la présence d’HO-IFO dans les suspensions de NCLs utilisée a biaisé la cinétique de libération du composé HO-d’HO-IFO. La libération rapide d’HO-IFO a pu être expliquée par la présence d’HO-IFO non encapsulé au sein de la suspension de départ, celui-ci ayant ainsi diffusé directement dans le milieu de libération ce qui pourrait expliquer sa très forte libération lors des temps précoces.