Dans cette première partie, notre premier objectif était de proposer une stratégie de pharmacomodulation permettant d’effectuer spécifiquement la préactivation de l’IFO dans la position oxydée par les CYP lors de son métabolisme. Cette stratégie a été initiée par l’équipe en 2001 [298] par la mise en œuvre de la préactivation de l’IFO par une réaction d’oxydation anodique. Cette technique a permis de mettre au point un protocole permettant de synthétiser la forme biomimétique du HO-IFO par synthèse électrochimique du méthoxy-IFO (MeO-IFO) à partir de l’ifosfamide. Celui-ci est obtenu par greffage spéCelui-cifique du groupement méthoxy (MeO) en position 4 du cycle oxazaphosphorine, position oxydée in vivo lors du métabolisme de l’IFO. Notre objectif fut ensuite de mettre au point un protocole permettant la modification du vecteur préactivant l’IFO et ainsi obtenir un large éventail d’analogues préactivés de l’IFO. Ce panel de composés a été obtenu par échange du groupement méthyle par une variété de chaînes aliphatiques, saturées ou insaturées, comportant 1 à 30 carbones (C1 à C30). Une fois préactivés, ces analogues ont montré une activité cytotoxique en absence d’enzyme CYP et permettent ainsi de conduire, après une réaction d’hydrolyse, à la libération du HO-IFO, précurseur de l’entité responsable de l'activité alkylante (moutarde isophosphoramidée). La longueur de la chaîne alkyle ainsi que sa nature ont un rôle dans la vitesse de cette libération.
Ces composés ont été évalués in vitro sur des lignées cellulaires cancéreuses humaines pour évaluer leur activité cytotoxique par détermination de leur viabilité cellulaire en l'absence de CYP. En outre, dans certains cas, les composés préactivés acquièrent la propriété de s'auto-assembler dans l’eau sous la forme de nanoparticules qui ont été caractérisées par diffusion de lumière dynamique et microscopie électronique à transmission.
Nous présentons cette méthode réalisée pour la conception des composés préactivés de l’IFO et leurs évaluations in vitro ainsi que l’étude de la cinétique de libération de l’entité HO-IFO à partir des composés préactivés, ayant permis la validation de la preuve de concept de préactivation in vitro.
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Pre-activated oxazaphosphorines designed for isophosphoramide mustard delivery as bulk form or nano-assemblies: synthesis and proof of concept.
Charles Skarbek1,2,3, Lea L. Lesueur1,2,3, Hubert Chapuis4, Alain Deroussent1,2,3, Catherine Pioche– Durieu5, Aurore Daville1,2,3, Joachim Caron4, Michael Rivard6, Thierry Martens6, Jean-Rémi Bertrand1,2,3, Eric Le Cam5, Gilles Vassal1,2,3, Patrick Couvreur4, Didier Desmaele4 and Angelo Paci1,2,3,7,8.
(1) Université Paris-Sud, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (2) Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Laboratoire
de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (3)
Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris, Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancéreuses, UMR 8203, Villejuif, France-94805; (4) Université Paris-Sud, Institut Galien, UMR 8612, Châtenay-Malabry, France-92296; (5) CNRS UMR8126, Université Paris Sud 11, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France-94805 ; (6) Université Paris Est Créteil, Institut de Chimie et des Matériaux Paris-Est (ICMPE), UMR 7182, Thiais, France-94320; (7) Gustave Roussy Cancer Campus Grand Paris, Département de Pharmacologie et d'Analyse du Médicament, Villejuif, France-94805 ; (8) Département de Pharmacie Clinique et de Pharmacocinétique, Université Paris Sud , Université Paris-Saclay, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, France-92296.
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Schéma 14 : Représentation schématique du projet relatif à la préactivation de l’IFO. Etape 1 : préactivation de l’IFO
Chaînes saturées courtes
C1 C10 Absence de propriétés d'auto-assemblage Encapsulation au sein de nanocapsules lipidiques (NCLs) R-X = géranyloxy farnesyloxy squalényloxy mercaptosqualényloxy
Nécessite une métabolisation (prodrogue) Faible libération de l'entité active (<20% ) Protocoles hautes doses
Toxicités dues au métabolisme Absence de spécificité
IFO
Pharmacomodulation
Chaînes insaturées (terpéniques)
C10 C30
Propriétés d'auto-assemblage en milieu aqueux
Formulation sous formes de nanoparticules terpéniques (NPTs) R-X-IFO R=C10-C30 Nanocapsules lipidiques (NCLs) Nanoparticules terpéniques (NPTs)
R-X-IFO formes libres (FLs) R-X-IFO R=C1-C10
2
3
1
PREACTIVATION Aucune bioactivation nécessaire
Libération accrue du métabolite actif (>95% ) Diminution des doses administrées (à confirmer) Diminution des toxicités spécifiques (à confirmer)
Amélioration de la spécificité (effet EPR) (à confirmer) R-X-IFO
R-O-IFO EVALUATION PHARMACOLOGIQUE ET PHARMACEUTIQUE: Optimisation formulation Stabilité colloïdale Stabilité chimique Etude de libération Evaluation in vitro Détermination IC50 Evaluation in vivo Pharmacocinétique Efficacité Dose maximale tolérée
R = CH3 C5H11 C10H21
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Discussion de l’article
Cette première partie nous a permis de concevoir et de synthétiser des analogues préactivés de l’IFO grâce au couplage de chaînes aliphatiques sur la position oxydée lors du métabolisme de l’IFO, et donnant lieu à la synthèse de sept analogues préactivés de l’IFO. L’activité cytotoxique de ces analogues a été menée sur deux lignées cellulaires cancéreuses humaines en comparaison à celle du HO-IFO. L’ensemble des analogues se sont montrés actifs en absence de CYP in vitro permettant de mettre en évidence la preuve de concept de préactivation. L’activité de l’IFO en présence de CYP n’a pas montré de résultats cohérents du fait du cumul de l’activité du HO-IFO à celle des deux métabolites toxiques : l’ACR et le CAA, l’activité des analogues a donc été comparée à celle de l’HO-IFO obtenu par réduction du HOO-l’HO-IFO [411] et non par métabolisation de l’l’HO-IFO en présence de CYP. La caractérisation des composés terpéniques capables de s’auto-assembler a pu être réalisée par DDL et par MET permettant la détermination de leur diamètre. Au vue de leur taille, ces nanoparticules sont susceptibles de profiter du de ciblage passif de la tumeur par l’intermédiaire de l’effet EPR [412]. L’étude ex vivo de la libération de l’entité clef (HO-IFO) dans le plasma de souris a permis de valider la preuve de concept de préactivation. Préalablement à cette étude, nous avons développé et validé la méthode de quantification simultanée du HO-IFO et des analogues préactivés de l’IFO par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) [413] qui a été appliquée pour doser les composés lors de cette étude de libération.
Ces composés ainsi conçus peuvent être répertoriés en deux groupes (Schéma 14) :
1) le premier, correspondant aux analogues n’ayant pas la propriété de s’auto-assembler sous la forme de nanoparticules et correspondant à une préactivation avec des vecteurs alkyles saturés de taille entre C1 et C10. Ces analogues n’ont pas de propriétés spécifiques de nanosystèmes, mais représentent des composés préactivés doués d’activité cytotoxique démontré
in vitro qui nécessite d’être formulés pour permettre une action in vivo. Ainsi, nous avons choisi de les encapsuler au sein de nanocapsules lipidiques afin de leur apporter une protection de la dégradation, mais surtout, cette encapsulation permettra d’évoluer vers de nanosystèmes de petites tailles (environ 50nm) [414, 415] qui comme le premier groupe profiterait de la propriété de ciblage pour une spécificité d’action.
2) le second, regroupe les analogues obtenus avec des vecteurs alkyles insaturés et de types terpéniques de tailles allant de C10 à C30. Dans ce cas, ces analogues peuvent s’auto-assembler sous la forme de nanoparticules. Cette propriété innovante permet un ciblage passif et ouvre le chemin à de nouveaux développements tels que la pégylation et l’optimisation vers des nanosystèmes de deuxième et troisième génération et dans le même temps une amélioration potentielle de leur spécificité d’action.
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