Matériel et Méthodes

Donneurs normaux et patients

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique institutionnel, et le consentement éclairé de chaque donneur a été obtenu avant la collecte des échantillons. Les PBMC des donneurs sains recrutés par la Division d’Hématologie et d’Immunodéficience de l’Hôpital Royal-Victoria ont été obtenus par aphérèse, puis enrichis par centrifugation sur du lymphocyte separation medium (Wisent). Les patients atteints de cancer du sein ont été recrutés par la banque de cancer du sein du Réseau Cancer FRSQ. Les PBMC ont été préparés à partir du sang prélevé, par la même méthode que pour les donneurs sains.

Cellules et réactifs

La lignée cellulaire tumorale MDA-MB-231 a été obtenue de l’American Type Culture Collection et la lignée 624.38mel a été établie et obtenue par le Surgery Branch (NCI/NIH). Les lignées cellulaires ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 auquel ont été ajoutés 10% de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur 30 min à 56°C, 2 mM de L- glutamine, 100 U/ml de pénicilline, 100 µg/ml de streptomycine et 10 µg/ml de gentamicine (Wisent).

Les lymphocytes T ont été purifiés à partir des PBMC des donneurs sains par sélection négative à l’aide du système d’enrichissement EasySep pour les lymphocytes T CD4+ et CD8+ humains (StemCell technologies Inc.).

L’IFN-γ et l’IL-13 recombinants humains ont été achetés respectivement de Pierce Endogen et de Peprotech. La fludarabine a été obtenue de Toronto Research Chemicals et de Tocris Cookson Inc et la cyclophosphamide de Calbiochem.

Préparation des surnageants de lymphocytes T activés

Pour la préparation des surnageants de lymphocytes T activés de donneurs sains, des lymphocytes T CD4+ ou CD8+ ont été isolés tel que décrit ci-haut, puis ont été stimulés pendant 24 h avec un anticorps anti-CD3 (clone OKT3, eBioscience) lié à la plaque (5 µg/ml dilué dans le PBS) ou avec le contrôle isotypique correspondant (eBioscience). Le surnageant a ensuite été récolté, puis centrifugé pour éliminer les cellules ou les débris cellulaires et a été conservé à -20°C.

Les TIL ont été préparés, selon un protocole adapté de Yannelli et collègues (276). Les échantillons cliniques de cancer du sein ont été coupés en petits morceaux de 1 mm2, puis ont été digérés enzymatiquement dans 10 mL de RPMI contenant 100 U/ml de penicillin, 100 µg/ml de streptomycin et 10 µg/ml de gentamicin avec un mélange de collagénase IV, Hyaluronidase, DNase pendant 16 h à température pièce pour le patient 1, ou de collagénase I, collagénase IV et DNase pendant 2 h à 37°C pour le patient 2. La suspension obtenue a été filtrée sur un Cell strainer de 40 μm (BD Falcon), suivi par deux lavages avec du PBS. Les TIL ont été enrichis par centrifugation sur du lymphocyte

separation medium (Wisent) et ont été cultivés à une concentration maximale de 2×106

cellules par ml dans un milieu de culture Iscove contenant 7,5% de sérum AB inactivé par la chaleur (Gemini) dans une plaque à 24 puits. À tous les 5 jours, la moitié du milieu a été remplacée par du milieu frais contenant 1×103 _{CU/ml d’IL-2. Lorsque le nombre de}

lymphocytes a atteint un minimum de 2×106 _{(entre les jours 17 et 25), les cultures ont subi}

un protocole d’expansion rapide (277,278). Brièvement, 1-5×105 _{TIL ont été cultivées avec}

2,5×107 _{PBMC irradiées provenant d’un minimum de 3 donneurs sains, 30 ng/ml d’anti-}

CD3 (clone OKT3), 300 IU d’IL-2 dans du milieu Iscove contenant 7,5% de sérum AB. Au jour 2, 300 IU d’IL-2 ont été ajoutées et au jour 5, le surnageant a été remplacé par du milieu complet frais contenant 300 IU d’IL-2. Entre les jours 8 et 10, le nombre atteint de lymphocytes était de l’ordre de 1-2×108 _{cellules. Les lymphocytes T CD8}+ _{ont été isolés}

par sélection négative, et les cellules restantes ont servi à préparer les surnageants de TIL, tel que décrit pour les lymphocytes T de donneurs sains, par stimulation avec de l’anti-CD3 ou le contrôle isotypique correspondant.

Traitement des cellules

Environ 2×105 _{cellules ont été distribuées dans des plaques à 12 puits et laissées à}

37°C pour la nuit dans 1 ml de milieu de culture RPMI complet. Le lendemain, le milieu de culture a été retiré, puis remplacé par du milieu frais contenant 10, 50 ou 100 µM de fludarabine, ou des quantités équivalente de DMSO servant de contrôle. Après 6 ou 24 h de traitement, le milieu a été retiré, puis remplacé par du milieu frais contenant ou non différentes concentrations d’IFN-γ recombinant humain, ou par du surnageant de lymphocytes T activés de donneurs normaux ou de lymphocytes T infiltrant la tumeur provenant d’échantillons cliniques du cancer du sein. Des stimulations d’une durée de 30 minutes ont été exécutées pour déterminer l’effet d’un traitement à la fludarabine sur la phosphorylation de STAT1, alors que des stimulations de 24 h ont servi à vérifier les effets sur l’induction de l’IDO. Après la période de stimulation, les cellules ont été placées sur glace, puis le milieu de culture a été retiré pour être remplacé par du PBS froid. Les cellules ont été récoltées à l’aide de grattoirs (policeman), puis ont été centrifugées à 4°C pendant 1 min à vitesse maximale (14 926 g). Les culots cellulaires ont été congelés dans un bain composé de glace sèche et d’éthanol, puis conservés à -80°C jusqu’à l’extraction protéique.

Immunobuvardage de type western

Les extraits protéiques ont été préparés dans du tampon de lyse Nonidet P-40, tel que décrit précédemment par Solis et al. (279). Brièvement, les culots cellulaires ont été resuspendus dans le tampon de lyse et ont été incubés sur glace pendant 20 min, suivi par 3 cycles de congélation dans un bain de glace sèche/éthanol puis de décongélation à 37°C.

Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation à vitesse maximale (14 926 g) pendant 30 min à 4°C. Les concentrations protéiques des surnageants ont été mesurées par la méthode de Bradford à l’aide du Dye reagent concentrate de Bio-Rad. Pour évaluer la phosphorylation de STAT1 et de STAT6 ainsi que l’expression totale de ces protéines, 7,5 à 10 µg des extraits ont été assujettis à une électrophorèse sur des gels d’acrylamide à 7,5%. Pour mesurer l’expression protéique de l’IDO, des gels d’acrylamide à 10% ont été utilisés. Suite à l’électrophorèse, les protéines ont été transférées sur des membranes de polyvinylidene fluoride (Immun-Blot, Bio-Rad), lesquelles ont été bloquées 1 h avec 5% de lait écrémé dilué dans du PBS/0,1% Tween 20. Les membranes ont été incubées pendant la nuit à 4°C avec des anticorps primaires de lapin (Cell Signaling technology) spécifiques à STAT1 (1:1000, clone 9172), STAT6 (1:1000, clone 9362), ou des anticorps phospho- spécifiques dirigés contre STAT1 tyr701 (1:3000, clone 9171), STAT1 ser727 (1:1000, clone 9177), STAT6 (1:1000, clone 9361), tous dilués dans du PBS/0,05% Tween 20/5% BSA. Les membranes ont ensuite été incubées pendant 1 h à température ambiante avec un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin (clone AP156P, Millipore, dilué dans PBS/0,1% Tween 20/, 5% lait; 1:2000 pour les phospho-STAT1, et 1:10000 pour STAT1, phospho- STAT6 et STAT6). L’expression de l’IDO a été évaluée avec un anticorps primaire polyclonal de mouton, anti-IDO humain (Hycult Biotechnology) dilué 1:100 dans du PBS/0,1% Tween 20, suivi d’un anticorps secondaire de lapin anti-mouton couplé à la peroxidase (1:10000, de Chemicon). Les bandes ont été révélées par une solution de détection chémiluminescente ECL Plus (Amersham) et visualisées par exposition sur autoradiogramme. Entre chaque révélation, les membranes ont été dépouillées de leur anticorps avec une solution Re-Blot Plus Mild (Millipore), selon les directives du manufacturier et bloquées de nouveau avec du lait.