Matériel et méthodes :

Les mises au point ont été réalisées sur des têtards au stade 26-27 (Gosner, 1960). Avant toute extraction mitochondriale, les têtards étaient mis à jeûner 48 à 72h. Ils étaient ensuite anesthésiés par une exposition au froid de quelques minutes, puis pottérisés dans du tampon d’extraction ; dès cette étape et jusqu’à la fin de l’expérimentation, tout se déroule à 4°C.

2.4.2.1 Tampon d’extraction et de respiration 1

1987). Les têtards sont donc pottérisés dans un tampon contenant 250 mM sucrose, 1mM EGTA et 20 mM Tris-HCl, neutraliser avec du KOH à pH 7,4 à 4°C, avec ou sans 2% BSA FFA (albumine sérique de boeuf délipidée ; la présence est précisée dans la partie « Résultat »). Les deux types de protocole d’extraction ont été testés avec ce tampon. Les capacités des mitochondries obtenues avec ce tampon d’extraction ont été mesurées dans un tampon respiratoire à « faible osmolarité » constitué de 120 mM KCl, 1 mM EGTA, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 20 mM glucose, 3 mM HEPES 0,3% ou 1% de BSA FFA à pH 7,4 à 20 °C.

2.4.2.2 Tampon d’extraction et de respiration 2

Les mitochondries ont été isolées et mises en suspension dans des tampons à « forte osmolarité » (environ 700 mOsm) qui sont utilisés classiquement pour les mitochondries de levures (Guérin et al., 1979). Les têtards sont donc pottérisés dans un tampon contenant 600 mM mannitol, 10 mM tris-HCl, 10 mM acide maléique, 2mM EGTA, 1mM EDTA, 0.5 mM Na2HPO4, 2% de BSA FFA, pH 7.4 à 4°C. Les deux types de protocole d’extraction ont été testés avec ce tampon. Les capacités des mitochondries obtenues avec ce tampon d’extraction ont été mesurées dans un tampon respiratoire à « fortes osmolarités » constitué de 20 mM Tris-base, 650 mM mannitol, 0.5 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, 1% BSA FFA (masse / volume), pH 7.4 à 20°C.

2.4.2.3 Protocole d’extraction 1

Environ 10 grammes de têtards dans le tampon d’extraction 1 ou 2 ont été homogénéisés par trois passage au Potter (Elvehjem). L’homogénat a été centrifugé à 800 g, 10 min. Le surnageant est mis de côté, le culot suspendu et centrifugé 10 min à 800 g. Les surnageants des 2 centrifugations à 800 g sont regroupés et centrifugés à 1000 g, 10 min. Le surnageant est filtré et centrifugé à 8700 g, 10 min. Le culot est suspendu dans le tampon d’extraction (1 ou 2, en fonction du protocole initial) puis centrifugé à 8700 g, 10 min. Cette

Etudes expérimentales

étape de lavage est répétée une seconde fois, puis le culot final est suspendu dans 200 μL de tampon d’extraction.

2.4.2.4 Protocole d’extraction 2

Le protocole d’isolement est similaire au précédent, avec une étape de purification des mitochondries par gradient de densité au Percoll. Après la première centrifugation à 8700g, le culot est resuspendu dans du tampon contenant 15 % de Percoll et déposé sur un gradient préformé d’une couche de percoll à 23%, elle-même déposée sur une phase de percoll à 40% et centrifugé à 31000 g pendant 5 min (Sims et Anderson, 2008). La suspension à l’interface des phases 23% et 40% de percoll est pipetée et diluée par 4 dans le milieu d’isolement puis centrifugée à 16000 g pendant 10 min. Le surnageant est retiré et le culot est dilué par trois volume de milieu d’isolement et centrifugé à 8700 g, 10 min. Le culot final est suspendu dans 200 μL de tampon d’extraction.

2.4.2.5 Respiration mitochondriale et rapport ATP/O

A l’issue des 2 types de protocole d’extraction, la teneur en protéines mitochondriales a été dosée avant de réaliser des mesures d’activité mitochondriale. La concentration protéique a été mesurée à 540 nm par la méthode du Biuret avec la BSA comme standard.

La consommation d’oxygène a été mesurée avec une électrode de Clark (Rank Brother LTD), dans une chambre en verre close, avec agitateur magnétique, dans un volume de 250 μL, thermostatée à 20°C. La suspension mitochondriale était mise en suspension dans du milieu respiratoire à faible ou à forte osmolarité (en gardant la continuité avec le protocole d’isolement). Le substrat respiratoire utilisé était le succinate (5 mM) en présence d’un inhibiteur du complexe I, la roténone (5 μM). La mesure des capacités oxydatives en condition phosphorylante (l’état 3 respiratoire) a été mesuré en présence d’ADP non limitant (1 mM), et les capacités oxydatives à l’état non-phosphorylant (état 4) ont été mesurées en présence d’oligomycine (2,5 μg/mL). Le rapport contrôle respiratoire (RCR), calculé comme

le ratio entre oxygène consommé à l’état 3 divisé par l’oxygène consommé à l’état 4, est un bon indicateur de la qualité de la préparation mitochondriale. L’activité de la cytochrome c oxydase ont été réalisées par l’ajout de myxothiazol 3 mM, d’ascorbate 4 mM et de TMPD 0,5 mM.

L’efficacité des oxydations phosphorylantes a été déterminée par le ratio entre le taux de synthèse d’ATP et la consommation d’oxygène sur les mitochondries isolées des têtards en présence du substrat succinate (5 mM, avec de la roténone 5 μM) avec un système de régénération de l’ADP contenant de l’hexokinase (1,5 U/mL) et du glucose (20 mM) avec 2 concentrations différentes d’ADP, 20 μM et 200 μM (adapté de Rigoulet et al., 1998; Nogueira et al., 2001; Clerc et al., 2007). La mesure de la synthèse d’ATP a été réalisée par le dosage du glucose-6-phosphate. Après un suivi du taux respiratoire de 5 minutes, 4 aliquots de suspension mitochondriale ont été prélevés de la chambre respiratoire toutes les 2 minutes et la réaction a été immédiatement stoppée par l’acide perchlorique (10 % HClO4 et 25 mM EDTA). Après centrifugation des protéines dénaturées (15000 g, 5 min), le surnageant était neutralisé avec une solution contenant 0,2 M de KOH et 0,3 M de MOPS. Le glucose-6-phosphate contenu dans l’échantillon a été mesuré par spectrophotométrie à 340 nm dans un tampon contenant 0,5 mM de NAD⁺, 50 mM de triéthanolamine-HCl, 7,5 mM MgCl2 et 3,75 mM d’EDTA, à pH 7,4 à température ambiante. La concentration de glucose-6-phosphate a été calculée par la différence entre le niveau de NADH avant et une heure après l’ajout de la glucose-6-phosphate déshydrogénase. La production mitochondriale d’ATP était alors calculée comme la pente de l’accumulation de glucose-6-phosphate dans l’échantillon sur l’intervalle de temps de prélèvement (soit 6 min). La linéarité de l’accumulation de glucose-6-phosphate nous permet de confirmer que le système est maintenu à un état stable. Nous avons vérifié que les teneurs en ATP mesurées soient spécifiques de l’activité de l’ATP synthétase en déterminant les taux de synthèse d’ATP en présence l’oligomycine (5 μg.mL^-1).

Etudes expérimentales

Respirations mitochondriales sous différentes conditions (nmol O/min/mg prot. mitochondriale)

Sans substrat _{(succinate 5mM)}^{Etat 2} _{(ADP 1 mM)}^{Etat 3} _{(Oligo 2,5} ^{Etat 4} _μg/mL) RCR

Ta m pon d' extract io n & cen trifugat io n dif férent iell e Tp faible Osm & Ø BSA &

Centri classique

1,77 ц Ϭ͕ϰϳΎ 2,34 ц Ϭ͕Ϯϴ 4,60 ц ϭ͕Ϭϵ 2,96 ц Ϭ͕ϳϰ 1,45 ± 0,23

Tp faible Osm & Ø BSA & Centri Percoll

ΕϬ Ø Ø Ø 1,14

Tp faible Osm & + BSA & Centri Percoll ΕϬ 1,05 2,00 1,60 1,28 Mes ur es en par allèl e Tp faible Osm & + BSA & Centri Percoll

ΕϬ 1,23 1,58 1,63 0,97

Tp forte Osm & + BSA & Centri Percoll

ΕϬ 2,45 4,18 2,27 1,90