1-2 Les MAPK

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Figure 19 : Schéma général de la voie des MAPK d’après (Kolch, 2005). La plupart des

récepteurs membranaires vont pouvoir activer la GTPase Ras. Une fois activée, elle va lier son effecteur la sérine/thréonine kinase Raf. Cette dernière initie alors une cascade de réactions enzymatiques impliquant les phosphorylations et activations successives des MAPKK MEK1-2 puis des MAPK Erk1-2. Celles-ci vont à leur tour pouvoir phosphoryler plus de 70 substrats, tant cytoplasmiques que nucléaires.

Abréviations : MAPK : mitogen-activated protein kinase ; MAPKK : MAPK kinase ; MEK : MAPK Erk kinase ; Erk : extracellular-regulated kinase.

Les souris délétées de la protéine Raf1 meurent au stade embryonnaire, soulignant ainsi l’importance physiologique de cette kinase. Les premières études ont tout d’abord montré que Raf était immunoprécipitée et colocalisait avec Ras activée (Hallberg et al., 1994). En fait, Raf se présente dans le cytosol sous forme phosphorylée et inactive car elle est dans une conformation auto-inhibée. Elle est de plus stabilisée dans sa forme inactive par interaction avec la protéine 14-3- 3. Lorsque le RTK est activée, il va y avoir déphosphorylation par les phosphatases PP1 et PP2A du site d’interaction de Raf avec 14-3-3, permettant à Raf d’interagir avec Ras liée au GTP et d’être ainsi activée (Jaumot and Hancock, 2001; Ory et al., 2003). En effet, Raf semble être activée par différents processus : la phosphorylation et l’interaction avec la membrane (pour revue voir (Wellbrock et al., 2004)). Il semble de plus que Raf puisse s’activer par hétérodimérisation, notamment entre B-Raf et C-Raf (Garnett et al., 2005).

Une fois activée, Raf peut initier la voie des MAPK Erk. En effet, Raf va préférentiellement lier et phosphoryler MEK grâce à un domaine riche en proline présent sur sa séquence mais absent chez

Récepteurs

Raf1, A-Raf, B-Raf

MEK1, MEK2

Erk1/MAPK, Erk2/MAPK

+ de 70 substrats nucléaires, membranaires, cytoplasmique ou du cytosquelette GTP

Ras Récepteurs

Raf1, A-Raf, B-Raf

MEK1, MEK2

Erk1/MAPK, Erk2/MAPK

+ de 70 substrats nucléaires, membranaires, cytoplasmique ou du cytosquelette GTP

Ras GTP Ras

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les autres MEKK. De plus, les différentes isoformes de Ras présentent des spécificités particulières. Ainsi, A-Raf activera MEK1 tandis que Raf1 pourra lier MEK1 et MEK2. Dans certaines conditions, Rac1 et cdc42 pourrait coopérer avec Raf pour permettre une activation plus efficace des MAPK. Ce mécanisme passerait par la kinase PAK1 (p21-activated kinase 1) qui phosphorylerait MEK, augmentant ainsi son affinité pour Raf (Frost et al., 1997). De plus, une autre kinase de la même famille, PAK3, permettrait aussi d’augmenter l’activation de Raf en la phosphorylant sur la sérine 388 (King et al., 1998). Il est à noter que des mutations activatrices de Raf sont retrouvées avec une fréquence élevée dans de nombreux cancers (Davies et al., 2002).

b) le module MEK1-2/Erk1-2

Une fois activée, Raf peut alors induire, par une série de cascades enzymatiques consistant en de simples phosphorylations des domaines kinases, l’activation des MAPK Erk1-2 qui vont alors pouvoir transloquer au noyau et y activer leurs cibles nucléaires. Les MEK1-2 et Erk1-2 sont des sérine/thréonine et tyrosine kinases, activées par changements conformationnels après phosphorylation (pour revue voir (Tanoue and Nishida, 2003)). Erk1 et Erk2 seront notamment phosphorylées sur les thréonine 183 et tyrosine 185 permettant ainsi une forte augmentation de leur activité kinase. Les Erk ne présentent pas de séquence de localisation nucléaire (NLS) et sont donc transportées dans le noyau grâce à des interactions avec diverses protéines telles que les GTPase Ran (Adachi et al., 1999). Une partie significative des Erk va rester dans le cytosol afin de phosphoryler des substrats cytoplasmiques dont certains peuvent intervenir dans des mécanismes de rétrocontrôle de la voie des MAPK.

c) les substrats des Erk1-2 - nucléaires :

Les premiers substrats de Erk identifiés ont été des substrats nucléaires parmi lesquels on peut compter de nombreux facteurs et régulateurs de transcription tels que Myc, Ets2, Elk, l’histone H3… Ces derniers conduiront à l’expression de gènes spécifiques tels que les gènes codant pour la cycline D1, p21 ou c-fos, permettant notamment la progression dans le cycle cellulaire et donc la prolifération (Widmann et al., 1999). Les facteurs de transcription activés par les Erk1-2 présentent souvent un domaine FXFP permettant ainsi leur interaction avec les MAPK et une phosphorylation plus efficace (Jacobs et al., 1999).

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comptant 10 membres (pour revue voir (Gaestel, 2006)). Parmi les MPK activées par Erk1-2, on distingue 3 groupes : les RSK, les MSK et les MnK (MAPK interacting kinase) ou MK. Ces MPK peuvent être nécessaires pour l’assemblage, la localisation et l’activation des complexes de signalisation induits par les Erk. Ces interactions permettent aussi de réguler l’efficacité et la spécificité enzymatique des MAPK. Ainsi, les RSK et les MSK régulent la transcription de divers gènes en phosphorylant notamment Foxo ou CREB (cAMP-Responsive-Binding-Protein), facteur de transcription anti-apoptotique, mais aussi de l’histone H3 (Bonni et al., 1999). Les MNK, quant à elle, vont plutôt réguler la traduction en agissant par exemple sur le régulateur de traduction eIF4E.

d) mise en place et régulation de la voie des MAPK

Il est maintenant admis que la durée de l’activation de la voie des MAPK ainsi que son bon contrôle sont nécessaires car ces paramètres peuvent faire varier l’effet biologique qui leur est associé (pour revue voir (Murphy and Blenis, 2006)). Ainsi, sur des cellules PC12, une activation soutenue des MAPK induira plutôt un processus de différenciation, alors qu’une activation transitoire entraînera la prolifération (Marshall, 1995). Pour contrôler tous ces processus, les MAPK possèdent différents partenaires : des protéines dites d’ancrage et d’assemblage, ainsi que des régulateurs positifs et négatifs.

- les protéines d’ancrage et d’assemblage :

Deux types de protéines vont permettre cette fine régulation, il s’agit de protéines adaptatrices dites d’ancrage ou de protéines plus « grosses » dites d’assemblage (pour revue voir (Dhanasekaran et al., 2007)). Le processus d’ancrage va se faire par interaction entre 2 protéines par des régions spécifiques, notamment le domaine CD (Common Docking), alors que le processus d’assemblage va mettre en jeu une protéine qui va être capable de lier plusieurs partenaires permettant ainsi de rapprocher les enzymes et leurs substrats par exemple. Elles vont donc servir de véritables plateformes d’ancrage en facilitant l’activation des MAPK. Plusieurs protéines ont à ce jour été caractérisées. KSR (kinase suppressor of ras) est une famille de protéines majeure dans la signalisation induite par les RTK comptant 2 membres, KSR1 et KSR2. C’est une protéine ayant la capacité, sous stimulation, d’interagir avec Raf, MEK et Erk. Ainsi, dans des cellules au repos, KSR1 est séquestrée dans le cytosol par la protéine 14-3-3 et est associée avec une E3-ubiquitine ligase et la phosphatase PP2A (Matheny et al., 2004; Muller et al., 2001). Lorsque le RTK est stimulé, il y a libération de KSR, notamment par l’intermédiaire de Ras qui va activer PP2A, permettant ainsi la déphosphorylation de KSR sur ses sites d’interaction avec 14-3-3 (Ory et al., 2003). Cette étape va permettre le recrutement de KSR à la membrane qui va alors interagir avec Raf, MEK et Erk. Il est à noter que KSR1 est la seule protéine « scaffold » de la voie des MAPK dont la localisation change après activation des RTK. De plus, bien que KSR possède un domaine kinase, les données ne sont pas claires quant à sa fonctionnalité et il ne semble pas nécessaire pour son activité d’assemblage. En plus de KSR, la protéine MP1 (MEK Partner 1) a été identifiée pour

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sa capacité à interagir avec Erk et MEK. C’est une petite protéine localisée dans les endosomes et pouvant lier de façon spécifique MEK1 et Erk1, mais pas Erk2, MEK2 ni Raf (Wunderlich et al., 2001). Elle apparaît nécessaire pour une pleine activation des MAPK en réponse à l’EGFR mais pas au PDGFR (Pullikuth et al., 2005; Teis et al., 2002). De même, sa localisation dans les endosomes apparaît indispensable pour sa bonne fonctionnalité. Il est à noter que la protéine MORG1 (MAPK Organizer 1), s’associant avec Raf, MEK et Erk a été isolée en tant que partenaire de MP1. Il semble toutefois que le rôle de MORG1 soit dépendant du ligand et plus spécifique de l’activation des MAPK induite par les RCPG et leurs ligands tels que le LPA que de celle induite par les RTK (Vomastek et al., 2004).

Sef est une autre protéine, présente elle aussi dans un compartiment cellulaire particulier,

l’appareil de Golgi (Torii et al., 2004). Elle est capable de lier MEK activée et Erk en aval des RTK. Les MAPK ne peuvent donc plus migrer vers le noyau et phosphorylent ainsi leurs substrats cytoplasmiques. Il existe une autre protéine capable de lier Erk, particulièrement décrite en aval de Met : la paxilline (Ishibe et al., 2003). C’est un composant intégral des point focaux d’adhésions et elle présente une interaction constitutive avec MEK, et sous stimulation avec Raf et Erk. La liaison de Erk avec la paxilline est dépendante de Src et lorsque Erk est activée, elle peut alors phosphoryler la paxilline permettant ainsi une activation de PI3K et de Rac (Ishibe et al., 2004).

Figure 20 : Schéma général de l’assemblage de la voie des MAPK (d’après (McKay and

Morrison, 2007)).

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favorisant sa phosphorylation par Src et ainsi sa pleine activation (Ziogas et al., 2005). Il est à noter que PEA15 (phosphoprotein enriched in astrocytes) séquestre Erk dans le cytoplasme en interférant avec sa liaison avec les nucléporines (Whitehurst et al., 2004) ou en la redirigeant du noyau vers le cytosol par exposition d’une séquence d’export nucléaire (Formstecher et al., 2001). Dans ce cas particulier, PEA15 peut être considéré comme un régulateur négatif de Erk concernant ses substrats nucléaires, mais comme régulateur positif pour ses activités cytoplasmiques.

- régulateurs négatifs :

Les Erk présentent en effet des régulateurs négatifs, de natures diverses et variées. Tout d’abord,

Erbin a été identifiée comme possédant la capacité d’interagir avec Raf, empêchant ainsi son

interaction avec Ras (Dai et al., 2006). De la même façon, la famille des RKIP (Raf kinase inhibitor protein) va pouvoir interagir avec les domaines kinases de Raf et MEK, empêchant ainsi leur activation (Yeung et al., 2000). Plus récemment, une nouvelle famille de protéines inhibitrices a été identifiée : les SPRED (Sprouty-Related Protein with EVH1 Domain). Elles vont interagir avec Raf, induisant ainsi sa séquestration et empêchant son activation (Sasaki et al., 2003; Wakioka et al., 2001).

Figure 21 : Résumé des principales protéines d’ancrage et d’assemblage de la voie des MAPK et de ses inhibiteurs impliqués en aval des RTK (d’après (McKay and Morrison, 2007)).

Les protéines d’ancrage et d’assemblage sont indiquées dans le cadre de gauche et les régulateurs dans le cadre de droite, les positifs et négatifs étant respectivement notés + et -.

Abréviations : RTK : receptor tyrosine kinase; MEK : MAPK Erk kinase, Erk : extracellular- regulated kinase; KSR : kinase suppressor of ras; MP1 MEK partner 1; CNK : connector enhancer of KSR; RKIP : raf kinase inhibitor protein; SPRED : Sprouty-Related Protein with EVH1 Domain.

De plus, il existe de nombreuses MKP (MAPK phosphatase), jouant un rôle dans l’inactivation de Erk (Tonks and Neel, 2001). Ce sont donc des phosphatases à double spécificité et cette famille compte 10 membres parmi lesquels on retrouve notamment MKP3, Pyst2, MKP4 et B23 (Lewis et al., 1998). Elles sont de façon générale localisées dans le noyau, comme MKP1 et MKP2, et la transcription des gènes codants pour ces phosphatases est généralement activée par les MAPK elles- mêmes, permettant ainsi la mise en place d’un véritable rétrocontrôle négatif (Volmat et al., 2001).

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MKP3, par contre, demeure cytosolique et semble très spécifique des Erk. Parmi les phosphatases régulatrices des MAPK, on compte aussi PP1 et PP2A, capables de déphosphoryler MEK et Raf.

Enfin, un dernier mécanisme de régulation de la voie Ras/MAPK faisant intervenir Grb2 a été caractérisé. En effet, lors d’une stimulation par l’EGF, Grb2 peut être phosphorylé sur tyrosine (tyrosine 209), conduisant ainsi à sa dissociation de Sos tout en maintenant son association avec le récepteur. De ce fait, Grb2 phosphorylé peut agir comme un véritable dominant négatif, empêchant le recrutement de molécules additionnelles de Sos et créant ainsi un véritable rétrocontrôle négatif (Li et al., 2001).