3-2 Les protéines Gab (Grb2-associated binder)

Les protéines de la famille Gab sont des protéines adaptatrices très proches des IRS et FRS. Cette famille compte un membre chez la drosophile, DOS (Daughter Of Sevenless), un autre chez C.elegans, Soc1 (Suppressor of clear) et 3 chez les mammifères, Gab1, Gab2 et Gab3 (pour revue voir (Gu and Neel, 2003)). Gab1 a tout d’abord été clonée en 1996 lors d’une recherche de partenaires protéiques associés au domaine SH3 de Grb2 et a été identifiée comme phosphorylée en réponse à l’EGF ou l’insuline (Holgado-Madruga et al., 1996). Gab2 et Gab3 ont, quant à elles, été clonées respectivement grâce à leur capacité à lier la phosphatase SHP-2 et par analogie de séquence avec Gab1 (Gu et al., 1998; Wolf et al., 2002). Depuis, les Gab ont été impliquées dans de nombreuses voies de signalisation induites par divers facteurs de croissance, cytokines ou hormones.

D’un point de vue physiologique, Gab1 est ubiquitaire et est indispensable durant le développement. En effet, la délétion de son gène dans des souris entraîne une mort embryonnaire précoce avec de graves défauts de développement du cœur, de la peau, du placenta et du muscle squelettique, ressemblant fortement au phénotype observé lors de la délétion de plusieurs RTK (EGFR, PDGFR, Met) (Itoh et al., 2000; Sachs et al., 2000). De plus, un récent KO spécifique de Gab1 dans le foie a montré que la protéine jouait un rôle majeur dans le transport du glucose en réponse à l’insuline notamment (Bard-Chapeau et al., 2005). L’expression de Gab2 semble elle aussi ubiquitaire mais est cependant bien moins élevée que celle de Gab1, excepté dans les cellules hématopoïétiques (Wolf et al., 2002). Cependant, les souris dépourvues de Gab2 sont viables et ne présentent pas de phénotype particulier, mise à part une diminution de la réponse allergique (Gu et al., 2001). Ces résultats suggèrent que l’absence de Gab2 doit être compensée par la présence de Gab1 ou Gab3. Ce dernier, quant à lui, semble avoir un panel d’expression plutôt spécifique des cellules hématopoïétiques et jouerait un rôle dans la différenciation des macrophages (Wolf et al., 2002).

D’un point de vue structurel, les protéines Gab se composent d’un domaine PH en N-terminal particulièrement bien conservé, de domaines riches en proline ayant une affinité pour des domaines SH3, et de nombreuses tyrosines qui, une fois phosphorylées, représentent des sites d’ancrage pour des protéines à domaines SH2 ou PTB.

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Figure 12 : Structure des protéines Gab (d’après (Liu and Rohrschneider, 2002)). Schéma des

structures des trois protéines Gab chez les mammifères (Gab1, Gab2 et Gab3), de celle de la drosophile (DOS ou daughter of sevenless) et de celle de C. elegans (Soc1). Toutes les Gab possède un domaine PH en N-terminal, un domaine central riche en proline (PRD) permettant notamment la liaison de Grb2 par ses domaines SH3 et de nombreuses tyrosines pouvant être phosphorylées et ayant une affinité pour divers domaines SH2 tels que ceux de p85. Gab1 est la seule à posséder un site d’interaction direct avec le récepteur Met.

Le domaine PH de Gab1 peut donc lier les phosphoinositides et semble avoir une affinité particulière pour le PIP3 (phosphatidylinositol 3,4,5 trisphosphate) (Isakoff et al., 1998; Maroun et al., 1999a). Il semble de plus indispensable à la fonction biologique de Gab1 dans certaines conditions car un mutant de Gab1 délété de son domaine PH ne peut plus induire la signalisation induite par le récepteur Met ni la tubulogenèse qui lui est associée même si il semble acquérir des propriétés oncogéniques (Maroun et al., 1999a; Maroun et al., 1999b). Il est de plus nécessaire pour la bonne localisation membranaire de la protéine, ce qui aiderait Gab1 à se stabiliser aux alentours du récepteur, permettant ainsi une signalisation soutenue et une activation maximale grâce à cette boucle d’amplification (Rodrigues et al., 2000).

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même façon que Gab1 n’est plus phosphorylée en réponse à l’EGF lorsque Grb2 n’est plus exprimée (Saxton et al., 2001). Nous avons cependant déterminé que le recrutement de Gab1 auprès de l’EGFR par Grb2 n’était pas le seul mécanisme existant et que sa présence membranaire auprès du récepteur pouvait aussi être dépendante de son domaine PH selon les conditions. Cette particularité sera discutée dans la partie « résultats expérimentaux ».

Il existe cependant un récepteur capable de lier directement Gab1. En effet, Gab1 présente un domaine particulier, le MBD (Met Binding Domain), absent de Gab2 et Gab3 et lui permettant de lier directement Met lorsque celui-ci est phosphorylé sur tyrosine (Schaeper et al., 2000; Weidner et al., 1996). Ainsi, même si Met peut aussi recruter Gab1 par l’intermédiaire de Grb2 (Bardelli et al., 1997; Fixman et al., 1997), il est aussi le seul récepteur capable d’interagir directement avec la protéine adaptatrice.

Les Gab présentent aussi différentes tyrosines qui vont être phosphorylées en réponse à de nombreux agonistes, permettant ainsi l’association de la protéine adaptatrice avec de nombreuses protéines à domaine SH2 ou PTB. L’une des premières protéines identifiées comme liant Gab1 est la tyrosine phosphatase SHP-2 (SH2 domain-containing tyrosine phosphatase) (Cunnick et al., 2001). En effet, toutes les Gab, ainsi que leurs orthologues chez les organismes inférieurs, sont capables de lier la phosphatase SHP-2 ou ses homologues. Cette interaction entre Gab1 et SHP-2 apparaît nécessaire pour l’activation de nombreuses voies de signalisation et notamment la voie des MAPK, probablement en amont de Ras, que ce soit pour son maintien ou son initiation selon les modèles. Ce rôle plus particulier de la phosphatase SHP-2 et de Gab1 dans l’activation des MAPK sera discuté et développé plus profondément dans la suite du chapitre (paragraphe II-2).

De la même façon, Gab1 a été identifié comme pouvant lier la sous-unité p85 de la PI3K. En effet, Gab1 porte dans sa séquence 3 motifs YXXM représentant la séquence consensus de liaison de p85. Ainsi, Gab1 présentant une mutation de ces motifs n’est plus capable d’activer la voie PI3K, illustrant donc l’importance de cette interaction dans cette voie de signalisation (Holgado- Madruga et al., 1997; Ong et al., 2001). Le rôle plus particulier de Gab1 et de la phosphatase SHP-2 dans l’activation de la voie PI3K est développé plus en détail dans la suite de ce chapitre (paragraphe III-6).

Enfin, Gab1 présente aussi des sites d’interaction avec d’autres protéines de la signalisation telles que la PLCγ, qui sera ainsi recrutée et activées auprès de divers récepteurs, notamment Met (Gual et al., 2000; Holgado-Madruga et al., 1996). La protéine adaptatrice Crk/CrkL est elle aussi recrutée par l’intermédiaire de Gab1 et jouerait notament un rôle dans la croissance cellulaire, notamment par l’activation de JNK (Garcia-Guzman et al., 1999; Lamorte et al., 2000; Sakkab et al., 2000). Il est à noter qu’une dernière protéine de 90kDa est elle aussi capable de s’associer à Gab1 mais n’a pour l’instant toujours pas été identifiée (Shi et al., 2000).

Ainsi, la phosphorylation de Gab1, permettant le recrutement de différentes protéines est une étape indispensable dans la signalisation induite par de nombreux agonistes. Gab1 peut être phosphorylée par différentes kinases et sur divers sites. Dans un premier temps, c’est le récepteur activé lui-même ou la kinase qui lui est associée qui vont induire la phosphorylation de Gab1 mais ils ne semblent pourtant pas être les seuls. En effet, la kinase Src a été identifiée comme pouvant

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phosphoryler Gab1, directement sous HGF par exemple ou en réponse au LPA lors de la transactivation des RTK (Chan et al., 2003; Daub et al., 1997). Il semble de plus que la phosphorylation sur tyrosine ne soit pas la seule phosphorylation que puisse subir Gab1, et la protéine adaptatrice peut aussi être substrat de sérine/thréonine kinases, telles que Erk2 (Extracellular regulated kinase 2) (Roshan et al., 1999). Il semble cependant que cette phosphorylation ait des conséquences différentes selon le récepteur considéré. Ainsi, en réponse à Met, il s’agit d’une phosphorylation activatrice permettant le recrutement de molécules de p85 supplémentaires conduisant à la mise en place d’une boucle d’amplification entre PI3K et les MAPK (Grammer and Blenis, 1997; Yu et al., 2001). A l’opposé, la phosphorylation de Gab1 par Erk2 semble être un mécanisme de régulation négative en aval de l’EGFR en entraînant une diminution du recrutement de p85 et donc une inhibition de PI3K (Yu et al., 2002).