Méthodes et résultats

Les expressions géniques dans les 118 cDNA ont été déterminées par PCR en temps réel, en

normalisant les valeurs par rapport à l’expression du gène contrôle RPLPO avec le calcul du ΔC(t)

Figure 39 : Étude rétrospective de tumeurs mammaires humaines : évaluation du

potentiel prédictif de l’expression d’ERα36

A. À partir des échantillons de tumeurs ER+ et ER- obtenus par une collaboration avec des

chercheurs du Centre Paul Strauss, des PCR en temps réel ont été réalisées. Les résultats ont

permis d’analyser l’expression d’ERα36, ainsi que celles de marqueurs des voies non

génomiques de réponse aux œstrogènes ou de progression métastatique, référencés dans des

études antérieures comme étant lié à ERα36 (Zhang et al, 2011 ; Chaudhri et al, 2012 ; Ajj et

al, 2013). Les relations d’expression entre les différents gènes ont été modélisées à partir de

calculs de corrélations de rang adossées à des tests d’hypothèses classiques et ont permis

d’obtenir des réseaux statiques de corrélation d’expressions géniques (B).

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(Figure 39). L’expression de chaque gène a été analysée en triplicat dans chaque échantillon, afin

d’établir une valeur moyenne de l’expression génique.

La liste des marqueurs étudiés a été établie à partir de ce qui était connu dans la bibliographie du

cancer du sein :

 ERα66, ERα36, GPER, HER2, EGFR et DDB2 sont impliqués dans la signalisation aux

œstrogènes.

 CXCR4, MMP9, RANKL, SNAIL1 et VIM ont été décrits pour avoir un rôle dans la

progression tumorale. Ce sont des marqueurs caractéristiques des processus migratoires ou

invasifs.

À partir des résultats des expressions géniques dans chaque tumeur et dans l’objectif d’évaluer les

dépendances entre les gènes, nous avons élaboré un programme à façon sur Matlab permettant de

calculer des coefficients de corrélation, des informations mutuelle totales et partielles. Aussi,

différents outils statistiques et tests d’hypothèses ont été utilisés pour évaluer l’existence ou pas de

liens entre les gènes :

- Évaluation des corrélations linéaires et non linéaires (de rang),

- Évaluation de l’information mutuelle entre gènes,

- Évaluation de l’entropie conjointe ou conditionnelle quand le nombre de données était jugé

suffisant,

- Introduction de changements dans les données en utilisant des tests de Monte-Carlo

(permutations de valeur) pour évaluer la significativité des résultats de dépendance obtenus.

Suivant le nombre d’échantillons, nous avons croisé les résultats obtenus et utilisé divers tests

d’hypothèse. Les résultats de dépendance obtenus ont permis la construction d’une nouvelle

classification de tumeurs mammaires basée sur les relations d’expressions entre les gènes.

Afin de discriminer au mieux les nouvelles classes, un calcul de distance est réalisé. Pour chaque

niveau d’expression du gène étudié, un réseau inférieur à ce seuil et un réseau supérieur à ce seuil

Figure 40 : Calcul du seuil d’expression optimal d’ERα36 permettant de discriminer de

nouvelles populations tumorales

A. Construction de réseaux de corrélation. De nouvelles populations de tumeurs ont été définies

d’après les résultats de PCR en temps réel en fonction de la valeur d’expression de chaque

marqueur de l’étude. Dans le cas d’ERα36, pour chaque valeur d’expression du marqueur, nous

avons obtenu deux populations de tumeurs : une classe inférieure qui regroupe des tumeurs

présentant une expression d’ERα36 inférieure au niveau d’expression choisi et une classe

supérieure avec un niveau d’expression plus élevé. À chaque valeur d’expression d’ERα36, les

réseaux de corrélation d’expression génique dans les deux populations tumorales ont été

construits. B. Calcul de la distance entre les réseaux de corrélation. Pour chaque valeur

d’expression d’ERα36, nous avons calculé la distance entre les réseaux obtenus dans la classe

inférieure et la classe supérieure à cette valeur. Nous comparons la corrélation d’expression

pour chaque couple de marqueurs en commun dans les deux réseaux. La somme de ces distances

est calculée.

Figure 41 : Détermination et validation du seuil d’expression obtenu

A. Ce graphique permet de visualiser le seuil d’expression optimal qui discriminera au mieux

les 2 populations de tumeurs, afin de potentiellement séparer 2 comportements

physiopathologiques distincts. À ce seuil, la valeur d’expression d’ERα36 montre la distance

maximale entre les réseaux de chaque population tumorale. Nous distinguons au mieux 84

tumeurs exprimant faiblement ERα36 et 34 tumeurs exprimant fortement ERα36. B. Dans les

tumeurs exprimant faiblement ERα36, nous observons une corrélation d’expression négative

entre ERα36 et la vimentine ou MMP9 et positive avec GPER et EGFR. Une expression forte

d’ERα36 est corrélée positivement à l’expression de SNAIL, VIM et MMP9. Ce travail nous

mène à la conclusion qu’une forte expression d’ERα36 semble reliée à une progression

métastatique des tumeurs mammaires, c’est-à-dire à des processus de migration cellulaire. En

revanche, une plus faible expression d’ERα36 serait en lien avec l’expression de marqueurs de

voies non génomiques de réponse des œstrogènes, ce qui semblerait montrer une croissance

tumorale oestrogéno-dépendante, sans migration.

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sont construits. Le calcul de distance se fait alors par comparaison entre ces deux réseaux et cela

pour chaque niveau d’expression du gène d’intérêt (Figure 40A). Les sommets des réseaux

représentent les gènes et les arcs, les corrélations d’expression entre les 2 gènes reliés entre eux.

Les gènes qui ne sont pas corrélés à l’expression d’un autre gène sont exclus du calcul de distance.

Le calcul de distance entre le réseau « inférieur » et le réseau « supérieur » au seuil d’expression

du gène étudié se fait par le calcul de distance entre les deux graphes les représentant en comparant

le lien entre chaque couple de gènes dans les deux graphes et ainsi l’existence et le signe de chaque

arc composant ces deux graphes. Pour une classification basée sur l’expression d’ERα36 par

exemple, nous avons pour chaque niveau d’expression calculé cette distance comme suit (Figure

40B).

On initialise la distance entre les deux graphes à zéro. Pour chaque couple de gènes :

 Si la dépendance d’expression n’est pas dans le même sens pour les 2 réseaux (arcs existants

mais de signes opposés), la distance entre les deux réseaux est incrémentée d’une valeur de

2.

 Si la corrélation d’expression existe pour un réseau et pas pour l’autre réseau, une valeur

(distance) de 1 est incrémentée.

Ce calcul est réalisé pour chaque couple de marqueurs à chaque niveau d’expression du gène étudié

pour la classification. On obtient donc un graphique représentant la distance calculée entre les

réseaux pour chaque niveau d’expression d’un gène classificateur (Figure 41A). C’est à partir de

ce graphique que l’on peut établir le seuil optimal qui s’obtient quand on a une distance maximale

entre les réseaux de gènes. Dans le cas d’ERα36 comme classificateur de tumeurs mammaires, le

seuil de 8,35 permet de séparer 2 réseaux très différents regroupant pour le réseau inférieur (ayant

la plus faible expression du variant) 84 tumeurs et dans le réseau supérieur (ayant la plus forte

expression) 34 tumeurs. Nous avons appliqué cette méthode pour tous les gènes étudiés. Certains

marqueurs comme ERα36 sont de bons classificateurs, permettant de séparer deux profils de

corrélations d’expression très différents, mais il est à noter que ce n’était pas le cas de tous les

marqueurs étudiés.

À partir de ces 2 familles de tumeurs mammaires discriminées vis-à-vis de leur expression du

variant de récepteur α aux œstrogènes, nous avons étudié les relations d’expression des marqueurs

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entre eux. Nous avons pu constater qu’une faible expression d’ERα36 était corrélée avec

l’expression forte des récepteurs GPER, EGFR, ainsi que le marqueur DDB2, et inversement

corrélée aux marqueurs métastatiques MMP9 et VIM. Tandis que dans les tumeurs présentant une

forte expression d’ERα36, une corrélation positive d’expression est visible avec les marqueurs

métastatiques SNAIL1, MMP9 et VIM, indépendamment des récepteurs étudiés (Figure 41B).

Dans le document Impact d'une surexpression d'ERα36 et/ou d'une exposition aux alkylphénols sur la physiopathologie de la glande mammaire (Page 127-133)