II. Aérosol microbiens
II.2. Méthodes de quantification des microorganismes
Il existe plusieurs méthodes de dénombrement des microorganismes. Certaines ont été précisées dans le chapitre 1. Le Tableau II- 1 les résume. Chacune présente sa spécificité, ses avantages et ses inconvénients. L’absence d’une méthode universelle imposée quant à l’évaluation des aérosols microbiens dans l’air contraint à procéder à la sélection de méthodes de quantification parmi les existantes. Les deux méthodes suivantes ont été choisies pour cette étude :
- La méthode de dénombrement des microorganismes sur milieux de culture, particulièrement intéressante puisqu’elle offre la possibilité d’analyser un grand nombre d’échantillons à faible coût. Des milieux de culture spécifiques permettent de sélectionner des espèces bactériennes et fongiques. Cette méthode est donc adaptée au suivi de la croissance de S. epidermidis et de P. oxalicum. Le principal inconvénient du dénombrement sur milieu de culture provient du résultat partiel obtenu qui ne délivre une information que sur la quantité de microorganismes cultivables, sans tenir compte des microorganismes viables/non cultivables et des microorganismes non viables.
- Des mesures du taux d’ergostérol qui concerne uniquement les espèces fongiques puisque l’ergostérol est le principal stérol des champignons. Cette analyse a l’avantage de quantifier tous les champignons présents sur le filtre (viables/non viables). Cette approche a été choisie afin d’obtenir des précisions quant à la croissance fongique, lorsque le taux d’ergostérol varie fortement.
Ces deux méthodes d’analyses et de quantification on été sélectionnées pour cette étude. Il serait néanmoins intéressant de compléter ces analyses par la quantification des microorganismes totaux ainsi que par l’étude de sous-produits bactériens et fongiques tels que les endotoxines, mycotoxines, allergènes,... En effet un certain nombre d’agents biologiques sont potentiellement mis en cause dans des SBS (Eduard et al., 2012) : des bactéries et des espèces fongiques non pathogènes, des composants microbiens tels que les mycotoxines, le β(1→3) - glucans, des allergènes, des enzymes (protéases, amylases, 113
protéines) ainsi que des endotoxines pour lesquelles des valeurs limites d’exposition ont été proposées dans certains pays.
Tableau II- 1. Tableau récapitulatif des avantages et inconvénients de quelques méthodes de quantification des microorganismes
Les adaptations des méthodes de quantification sélectionnées pour le suivi de
S. epidermidis et de P. oxalicum sont décrites ci-après.
Réponse Avantages Inconvénients
.
Méthode peu coûteuse.
Temps de réponse relativement longs (quelques jours).
Méthode simple à mettre en place: possibilité d'analyser un grand nombre d'échantillons.
Quantification des microorganismes cultivables uniquement.
Sélection des espèces selon le milieu de culture.
Possibilité de diluer les échantillons.
Quantification de la totalité de la biomasse: viable/non viable.
Grandes variations du taux d'ergostérol selon les espèces fongiques et le stade des cellules (spores, formation de mycélium, etc.).
Sensibilité de la réponse en cas de croissance fongique.
Temps d'extraction de l'ergostérol des cellules et temps d'analyse longs.
Marqueur très sensible de la viabilité microbienne.
Nécessité d'un matériel adapté : luminomètre.
Rapidité des mesures.
Délivre une information globale de l'activité cellulaire sans préciser les groupes microbiens mis en causeProtéique Biomasse totale
.
Analyses rapides et peu coûteuses.
Risques importants de contamination par des produits composés de protéines qui ne sont pas forcément issus des microorganismes.
Quantification des cellules viables/non viables ciblées.
Méthode coûteuse.
Précision de l'analyse.
Difficulté de trouver un primer universel.
Risques de contaminations importants.
Temps d'extraction et d'analyse longs Ergostérol Biomasse fongiquetotale PCR quantitative Selon primer (espèce / groupe etc.) Méthode sur milieux de culture Bactéries et champignons cultivables
ATP Activité totale microbienne
II.2.1. Méthode par culture
La méthode conventionnelle de culture sur boîte de pétri demeure la méthode la plus largement utilisée lors de suivis quantitatifs de microorganismes (ACGIH, 1999). Dans le cas de cette étude, le nombre d’espèces microbiennes à quantifier est limité à deux, ce qui facilite grandement le suivi des concentrations de ces espèces.
Les conditions de croissance et le choix des milieux nutritifs des deux espèces sont résumés dans le Tableau II- 2.
Tableau II- 2. Conditions de croissance de S. epidermidis et P. oxalicum sur milieu gélosé
La gélose de Chapman est un milieu nutritif sélectif des bactéries halophiles et particulièrement des Staphylococcus : sa teneur élevée en NaCl permet la sélection des bactéries halophiles en inhibant la croissance des autres bactéries.
La gélose dichloran rose bengale chloramphénicol (DRBC) sélectionne les levures et les moisissures en inhibant la croissance bactérienne par la présence d’un agent antibactérien, le chloramphénicol. L’utilisation d’un milieu spécifique pour le dénombrement de P.oxalicum permet de diminuer les problèmes liés à la contamination et de limiter le phénomène de compétition entre l’espèce bactérienne et fongique.
Dans les deux cas d’étude, un volume précis (entre 100 µL et 1 mL selon la concentration souhaitée) de l’échantillon liquide à analyser est étalé à différentes dilutions sur les milieux nutritifs gélosés respectifs. Les boîtes sont alors placées dans une étuve à la température souhaitée, le temps nécessaire à la croissance des microorganismes. La division cellulaire des bactéries et des espèces fongiques présentes sur le milieu nutritif donne naissance à une colonie comprenant un certain nombre de cellules bactériennes et de cellules fongiques. Seule la colonie est visible et dénombrable. Il est enfin déterminé un nombre de colonies cultivables par volume de solution analysée. L’unité utilisée est l’Unité Formant Colonies.mL-1 (UFC.mL-1).
Staphylococcus epidermidis Penicillium oxalicum
Milieu de culture Mannitol salt agar (Biokar diagnostics) Rose bengal chloramphenicol agar - soy based (Biokar diagnostics)
Temps de croissance (h) 24 72
Temperature (°C) 37 25
II.2.2. Evaluation du taux d’ergostérol
En plus de l’information sur la quantité de P. oxalicum cultivables, des mesures du taux d’ergostérol présent sur les filtres testés complètent l’analyse.
L’ergostérol est le principal stérol des champignons. L’ergostérol est considéré comme le marqueur le plus sensible de la biomasse fongique (Seitz et al ; 1977). Cependant, les taux d’ergostérol contenus dans les cellules fongiques ne sont pas constants et diffèrent selon les espèces, l’âge de la culture, l’étape du développement (phase de croissance, formation de l’hyphe, sporulation) et les conditions de croissance (pH, température,…) (Pasanen et al., 1999). C’est un élément important à considérer car selon l’état des moisissures, le taux d’ergostérol peut s’avérer bien différent.
Une courbe d’étalonnage de l’ergostérol a été obtenue à partir d’une solution mère à 664 mg/L d’ergostérol synthétique (Sigma – Aldrich ≥ 95%) dans du méthanol. La mesure de l’ergostérol est réalisée par chromatographie liquide à l’HPLC (Modèle 600E, Waters). La colonne utilisée est une Nova-Pack C18 (150 mm × 3.9 mm, I.D. 4 µm, Waters). La phase mobile, constituée uniquement de méthanol (Méthanol HPLC grade, Fisher), se déplace en mode isocratique à un débit de 1 mL.min-1. La détection du composé est assurée par un détecteur UV (Modèle 486, Waters) pour une longueur d’onde fixée à 282 nm.
Le protocole détaillé de l’extraction des esters d’ergostérol contenus dans le cytoplasme des cellules fongiques, ainsi que leur transformation en alcool par saponification, est développé en Annexe II- 1. Le coefficient d’extraction, évalué à partir d’une solution d’ergostérol synthétique dans du méthanol (Sigma – Aldrich ≥ 95%), atteint 63,7% ± 4.9%. La limite de quantification du taux d’ergostérol est déterminée à partir de la courbe d’étalonnage à 0,26 mg.L-1 de méthanol.
II.2.3. Suivi qualitatif du développement microbien par observations MEB Le suivi quantitatif des microorganismes a été complété par une analyse qualitative du comportement microbien sur les filtres grâce à des observations réalisées au Microscope Electonique à Balayage (MEB). La microscopie électronique à balayage consiste à observer sous haute résolution la topographie des surfaces. Elle offre la possibilité de révéler des objets submicroniques avec une bonne qualité d’image. Les spores fongiques du genre Penicillium ainsi que les bactéries du genre Staphylococcus présentent des tailles de l’ordre du micromètre à quelques micromètres. Il est ainsi possible de les observer au MEB. Avant observation, les échantillons de filtres subissent un dégazage puis une métallisation de surface sous vide par 116
une couche d’or-palladium. Le MEB utilisé est un JSM 5800LV de marque JEOL. Le comportement des microorganismes est suivi sur les filtres à différentes étapes de l’étude : consécutivement à la contamination des filtres mais aussi suite à leur positionnement à température et HR contrôlées pendant 48h et 168h.