IV. Suivi du comportement microbien sur les filtres
IV.2. Analyse des filtres
IV.2.1. Développement des microorganismes sur les filtres contaminés
Suite à la contamination des filtres par le consortium microbien, ceux-ci sont suspendus immobiles dans une atmosphère sous des conditions de température et d’humidité relative contrôlées. Les filtres ne sont plus soumis à un flux d’air afin de simuler le cas d’un arrêt de ventilation de CTA. Le schéma de la Figure II- 14 présente le dispositif expérimental permettant le contrôle de la température et de l’humidité relative :
- Le contrôle de l’humidité est réalisé par recirculation de l’air dans la boîte à un faible débit et à travers un système d’humidification (circuit d’eau) ou de séchage (grains de silice).
- Le système complet est placé dans une étuve à température contrôlée pour assurer une température constante au sein de la boîte hermétique.
- La température et le taux d’humidité relative sont mesurés régulièrement par un thermo-hygromètre dans l’enceinte.
Dans la suite de l’étude, deux temps d’arrêt de ventilation sont appliqués : 48h, soit un arrêt week-end et 168h, soit un arrêt représentatif d’une semaine de vacances.
Figure II- 14. Schéma du système expérimental de maintien des filtres sous atmosphère contrôlée
IV.2.2. Relargage microbien en aval des filtres
Une croissance bactérienne et/ou fongique sur un filtre peut entraîner des concentrations microbiennes anormalement élevées en aval de la filtration d’une CTA. En effet, lors d’un développement microbien, un filtre peut (Bonnevie-Perrier, 2008) :
- Se colmater plus rapidement, ce qui risque de favoriser un réentraînement de particules en aval des filtres.
- Subir une diminution de son efficacité lors de la consommation des particules collectées sur le filtre, voire le filtre lui-même, par les microorganismes alors à la recherche de sources nutritives nécessaires à leur croissance. De plus, des passages préférentiels sont également susceptibles de favoriser le relargage de microorganismes et de particules en aval des filtres.
Lorsqu’un développement microbien se manifeste, les filtres représentent donc une source potentielle de pollution de l’air. Dans le cas particulier où la ventilation est arrêtée sur une période, le redémarrage de la ventilation peut engendrer un à-coup de débit d’air qui peut occasionner le relargage des microorganismes.
Pour étudier le relargage microbien en laboratoire, Bonnevie-Perrier et al. (2008) ont développé un pilote de filtration schématisé en Figure II- 15. Le montage expérimental se compose d’une canalisation cylindrique droite en acier inoxydable de 45 mm de diamètre pour environ 1,5 m de longueur. L’échantillon de média filtrant contaminé se positionne à mi- longueur de la canalisation en configuration plane et perpendiculaire au flux d’air. La canalisation est positionnée verticalement, ce qui permet de limiter le dépôt de particules sur les parois. Un filtre est placé en aval du média filtrant testé. Il permet la collecte des 138
microorganismes relargués par le filtre testé. Les particules microbiennes relarguées et collectées par le filtre d’échantillonnage sont extraites via un protocole d’extraction spécifique présenté au paragraphe IV.2.3.
Figure II- 15. Colonne de filtration permettant d’étudier le relargage microbien provenant d’un filtre
La collecte des microorganismes relargués s’effectue sur une durée de 20 minutes par injection d’air comprimé à un débit de 12 L/min qui induit une vitesse de filtration de 0,16 m.s-1 au niveau du filtre testé, soit à la même vitesse de filtration que dans le dispositif servant à la contamination des filtres.
IV.2.3. Méthodes d’extraction des microorganismes des filtres
Préalablement à la quantification des microorganismes collectés sur les filtres, ceux-ci en sont extraits en suivant le protocole d’extraction optimisé dans une thèse précédente (Bonnevie-Perrier, 2008). La base de ce protocole provient d’une étude de Möritz and Martiny (1997) qui ont élaboré une méthodologie d’extraction spécifique à l’étude de la contamination des médias fibreux filtrants. Les travaux de Kemp et al. (2001) ainsi que des expériences complémentaires ont ensuite permis d’optimiser le procédé de base.
Les différentes étapes opératoires sont les suivantes (Bonnevie-Perrier, 2008) :
Introduction de l’échantillon du média à analyser dans un récipient de 200 mL contenant une solution stérile (autoclave 20 min, 121°C) composée de :
- 35 mL de MgSO4 (0,01 M)
- 15 mL de tween 20 (0,25% en volume) dans de l’eau déminéralisée Agitation (1 h, table d’agitation à 300 rotations par minute)
Passage aux ultrasons (100 W ; 20 kHz) pendant 1 min
L’efficacité de récupération des spores de P.oxalicum cultivables provenant du filtre est évaluée entre 80 et 85% pour le média filtrant testé (Bonnevie-Perrier, 2008). L’extraction est suivie d’une quantification des microorganismes.
L’application du protocole implique une longue agitation puis un passage aux ultrasons. Ces deux étapes peuvent induire des chocs et une détérioration des cellules microbiennes puis enfin une perte de la cultivabilité des microorganismes. C’est pourquoi l’application de la méthodologie d’extraction a été validée en termes d’effet sur la cultivabilité pour P. oxalicum et S. epidermidis. Les résultats sont présentés en Figure II- 16.
Figure II- 16. Etude de l’influence du protocole d’extraction des microorganismes sur leur cultivabilité
La Figure II- 16 présente les concentrations de P.oxalicum et S.epidermidis cultivables d’une suspension liquide avant les deux étapes du protocole d’extraction à savoir agitation et passage aux ultrasons. Les concentrations de P. oxalicum et S. epidermidis ne subissent aucune variation significative avant et après l’application du protocole. P. oxalicum maintient sa concentration autour de 105 UFC.mL-1 tandis que S. epidermidis avoisine 109 UFC.mL-1 tout au long de l’opération.
1E+00 1E+01 1E+02 1E+03 1E+04 1E+05 1E+06 1E+07 1E+08 1E+09 1E+10 P.oxalicum S.epidermidis Co nc en tr at io n ( U FC /m L)
Concentration au départ Concentration après agitation et passage aux ultrasons