Analyse Qualitative – Identification des espèces

Ces 15 dernières années, l’étude des microorganismes de l’environnement s’est fortement renforcée grâce à la détection et à l’identification par comparaison des séquences d’ADN ou d’ARN (Pace, 1997). La PCR a pour principe d’amplifier une séquence d’ADN spécifique (un gène spécifique ou une partie de gène) choisie puis d’en obtenir de multiples copies détectables à partir d’un certain seuil. Ensuite, les séquences obtenues peuvent être directement analysées et comparées avec des bases de données enregistrées pour l’identification. L’ARN peut également être utilisé après une 1ère étape préalable qui consiste à transformer l’ARN en ADN par une enzyme : la transcriptase inverse. Le large domaine d’étude couvert (bactéries, virus, champignons,…), sa très grande sensibilité et des temps courts d’analyse font de la PCR un instrument technologique très prometteur. La PCR a conduit à des avancées dans les sciences environnementales et de la santé en identifiant par exemple des pathogènes dans les aérosols, ce que la méthode de culture ne permettait pas. (Angenent et al., 2005 ; Schafer et al., 2003 ; Wakefield, 1996) Ainsi, la connaissance des populations bactériennes, fongiques et de la biomasse allergène dans l’air urbain s’est développée (Boreson et al., 2004 ; Wilson et al., 2002). Pour l’identification des espèces bactériennes et/ou fongiques, le principe de la méthode par PCR repose sur l’amplification des régions ADN présentes chez toutes les bactéries ou champignons et dont les séquences sont suffisamment différentes entre espèces pour permettre une identification précise. Les gènes de l'ADN ribosomique constituent une cible de choix : présents chez tous les microorganismes, ils sont connus pour accumuler des mutations à un taux constant (Bougnoux and Espinasse, 2003). Les séquences d’ARN sont bien décrites (Amann et al., 1995 ; Lane et al., 1985 ; Pace, 1997 ; Woese, 1987). Wu et al (2002) ont bâti une liste de primers de PCR utiles pour l’étude des champignons des aérosols. L’analyse par PCR la plus courante est l’identification d’une espèce bactérienne ou fongique (PCR qualitative) (Calderon et al., 2002 ; Maher et al., 2001 ; Mastorides et al., 1997 ; Myatt et al., 2004 ; Pascual et al., 2001 ; Sawyer et al., 1994 ; Stark et al., 1998 ; Wakefield, 1996 ; Wan et al., 2004). Les souches sont identifiées par comparaison des séquences (complètes ou partielles) avec celles contenues dans une banque de données. Néanmoins, les caractéristiques taxonomiques peuvent parfois être inexactes puisque fournies par les dépositaires des séquences.

Les avantages d’utiliser l’ADN comme cible pour l’identification des espèces sont : - La rapidité des analyses

- La reproductibilité

- La sensibilité de détection

- La détection des organismes viables et morts ce qui est particulièrement important pour l’étude des microorganismes de l’air dont la dangerosité n’est pas liée uniquement à la viabilité des organismes (Brasel et al., 2005, Hirvonen et al., 1997).

VII. Conclusion

L’air intérieur représente un enjeu sanitaire important. L’analyse de ses composants (particules, composés chimiques, radioactivité, composés biologiques) fait l’objet de nombreuses études. Les instances politiques et scientifiques françaises ont en effet pris conscience ces dernières années de la nécessité de développer des moyens afin d’accroître la connaissance et la maîtrise de la composition de l’air à l’intérieur d’espaces semi-clos.

La composition de l’air intérieur dépend de chaque lieu de vie qui peut être répertorié par catégorie. Ainsi, des études sont conduites dans des habitations, écoles, voitures, industries agroalimentaires, hôpitaux, secteur tertiaire,... En particulier, l’OQAI lance en 2012 une campagne nationale de mesure dans les bureaux. Dans le secteur tertiaire, le bureau est l’espace dans lequel un travailleur occupe le plus de temps après sa résidence. Or, des plaintes de salariés sont fréquemment recensées en lien avec une possible mauvaise qualité de l’air qu’ils respirent.

Les bureaux sont des lieux semis-clos qui présentent certaines spécificités. Des systèmes de ventilation et de CTA sont installés dans des immeubles de bureaux. Ces systèmes sont de grand intérêt à la fois pour fournir de l’air à une température et un taux d’humidité de confort pour les occupants mais aussi pour réduire les concentrations particulaires. Néanmoins, ils peuvent accroître la pollution de l’air lorsque la conception de la CTA est inadéquate, que la ventilation est inadaptée ou que la maintenance ou les conditions opératoires des CTA sont insuffisantes. Un rapport de l’OMS (WHO, 2009) rappelle qu’un taux de ventilation suffisant permet globalement de diluer les virus et agents infectieux mais lorsque le minimum de ventilation n’est pas atteint, la ventilation peut au contraire être vecteur de microorganismes pathogènes. Or, selon Li et al. (2007) les données sont encore insuffisantes pour établir des taux de ventilation minimum dans plusieurs espaces de vie tels que les bureaux. De même, alors que l’étape de filtration prévoit de réduire la concentration particulaire de l’air filtré, les filtres retiennent des microorganismes qui parfois se développent sur les filtres. Les propriétés de filtration peuvent alors se dégrader lorsque le colmatage du filtre est accéléré ou l’efficacité de filtration du média fibreux diminuée (Bonnevie-Perrier et al., 2008). Enfin, le relargage de microorganismes développés sur le filtre peut s’avérer particulièrement néfaste. Un tel relargage peut être favorisé lors de la remise en marche de la ventilation après une période d’arrêt. Les filtres ne sont en effet pas soumis à un flux d’air lors de l’arrêt de la ventilation. Or, un flux d’air peut provoquer une perte de viabilité des espèces microbiennes 104

(dessiccation, oxydation). Les conditions seraient donc plus favorables au développement microbien lors d’arrêt de ventilation.

Aucune valeur limite d’exposition aux aérosols microbiens n’est établie en France bien qu’ils soient souvent mis en cause dans des cas de SBS. Il est donc nécessaire de pouvoir évaluer les concentrations d’aérosols microbiens dans l’air intérieur et d’en limiter les sources. Les recherches bibliographiques mettent en évidence la complexité de l’étude des aérosols microbiens tant les microorganismes sont diversifiés : groupes, espèces, états (viables/non viables – morts). Les sous-produits et les fragments microbiens ne doivent également pas être négligés car ils sont liés à de nombreuses pathologies (allergies, problèmes respiratoires,...). Il est donc important de cibler les éléments recherchés en fonction des réponses attendues.

CHAPITRE 2

Développement d’une méthodologie pour l’étude du comportement

microbien sur des filtres

I. Introduction

Afin d’étudier l’influence de certains paramètres de gestion de CTA sur le comportement des microorganismes sur un filtre, il a tout d’abord été nécessaire de développer une méthodologie. Pour analyser séparément les facteurs d’influence et déclencheurs d’un développement microbien les opérations se sont déroulées dans des conditions contrôlées en laboratoire. Quelques études ont mis en évidence des comportements divers de microorganismes collectés sur médias fibreux, seulement plusieurs paramètres sont considérés et il est alors difficile d’établir clairement les impacts de chacun sur la croissance microbienne. Par exemple, Simmons and Crow (1995) précisent que sous des conditions de nutrition et d’humidité favorables, les microorganismes arrivent à croître. Maus et al. (2001) admettent que les bactéries et les spores fongiques peuvent survivre sur des filtres lors de périodes prolongées (> 5 j) tout en conservant leur aptitude à croître lorsque le taux d’humidité devient suffisant (> 70% HR), préférentiellement en absence de flux d’air. Finalement, ces études démontrent l’existence d’un développement bactérien et fongique sur des médias fibreux. Des hypothèses sont proposées sur les facteurs influençant la croissance mais manquent de corrélations précises à défaut de travailler sous conditions maîtrisées. Il s’avère néanmoins que des éléments soient récurrents : le taux d’humidité, le gâteau de particules collectées sur le filtre outre la nature du filtre lui-même pouvant faire office de source nutritive. L’absence de flux d’air serait aussi un élément favorisant la croissance microbienne.

Trois facteurs ont été sélectionnés pour être analysés plus en détail dans cette étude: - L’humidité relative

- La nature du média fibreux

- Le passage d’un flux d’air sur un temps donné

La ventilation est fréquemment arrêtée lors des week-ends et des vacances dans l’objectif de limiter la consommation d’énergie. Pour simuler un arrêt de ventilation sur un week-end et une semaine de vacances les filtres sont disposés sans flux d’air pendant 48h et 168h après avoir collectés des microorganismes. Afin de suivre différents aspects du développement microbien (quantitativement, qualitativement, relargage en aval des filtres) une approche méthodologique a été élaborée et est présentée dans ce chapitre ainsi que le matériel et les méthodes utilisés. Le schéma de la Figure II- 1 résume les grandes étapes méthodologiques.

Figure II- 1. Schéma récapitulatif des différentes étapes méthodologiques

Dans un premier temps, des filtres sont contaminés par un aérosol microbien. Après leur contamination, ceux-ci sont suspendus dans une enceinte fermée afin de maintenir un taux d’humidité relative et une température constants en l’absence de flux d’air. Le développement microbien sur le média fibreux contaminé et le relargage en aval du filtre sous flux d’air sont ensuite quantifiés.

Pour ce faire, ce chapitre décrit :

- Le choix des espèces microbiennes modèles

- La génération et l’échantillonnage de l’aérosol microbien

- Le dispositif expérimental de contamination des filtres et sa validation - Le principe appliqué pour la simulation d’arrêt et de redémarrage de CTA - Les méthodes de quantification des microorganismes