Méthodes d’analyse des composés volatils odorants

1. Méthodes d’extraction

Le vin est une matrice très complexe, constituée de centaines de composés volatils présentant des propriétés chimiques extrêmement variables. Ainsi, pour l’identification et la quantification de nouvelles molécules par chromatographie en phase gazeuse couplée à des détecteurs ad hoc, il est nécessaire d’extraire qualitativement et quantitativement, de façon sélective ou non, les molécules présentes dans le vin. La littérature scientifique abonde en techniques analytiques en adéquation avec l’objectif de l’analyste (Blanch et al. 1991, Etievant, 1987). Aussi, nous nous attarderons plus particulièrement sur les techniques d’extraction liquide/liquide et d’espace de tête.

a) Extraction liquide-liquide

Pour l’extraction non sélective d’un grand nombre de molécules organiques, y compris celles présentes à l’état de traces, l’extraction liquide-liquide est une technique de choix (Ortega-Heras et al., 2002). C’est une méthode simple et rapide. L’extraction est basée sur la différence

O

H SCH₃

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d’affinité d’un soluté entre deux phases liquides non miscibles (solvant organique – eau). Différents solvants doivent être testés afin d’optimiser l’extraction. Ces derniers doivent avoir une forte affinité pour les composés volatils et être non miscibles avec le vin. Ils doivent aussi avoir un point d’ébullition faible (Teb < 50°C) afin de permettre une concentration rapide et douce sans perte de composés volatils d’intérêt (Etiévant, 1987). Les solvants couramment utilisés pour l’extraction de composés odorants du vin sont le pentane, l’éther diéthylique, le dichlorométhane ou encore des mélanges azéotropiques de solvants de polarité moyenne. Dans un contexte d’analyse des extraits par chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie, il est utile d’évaluer la représentativité de l’extrait ainsi obtenu. Celle-ci est communément réalisée par un test de similarité en déposant de l’extrait sur une mouillette ; l’adéquation entre qualité de l’odeur de l’extrait et celle recherchée dans le vin ou le moût est évaluée. Une bonne note de similarité odorante correspond à une extraction liquide-liquide ad hoc. Enfin, du point de vue analytique, cette approche permet d’effectuer des dosages présentant une bonne reproductibilité.

b) Micro-extraction sur phase solide (SPME)

La SPME est une méthode d’extraction sans solvant, inventée par Pawliszyn et Alexandrou (1989), qui respecte la structure des échantillons. C’est une méthode simple basée sur les capacités de sorption/désorption d’une phase solide. Contrairement à l’extraction liquide-liquide, cette méthode permet d’extraire sélectivement les composés volatils du moût ou du vin (Vas et al., 1998a et b). Le principe de base repose sur l’existence d’un équilibre thermodynamique entre la quantité de molécules adsorbées sur la fibre et la quantité présente dans l’échantillon. L’extraction des molécules est réalisée par sorption sur une fibre en silice fondue revêtue d’un polymère ou d’un mélange de polymères, placée à l’intérieur d’une aiguille creuse amovible. Cette dernière est, soit introduite directement dans l’échantillon s’il s’agit de liquide simple ou de gaz, soit exposée à l’espace de tête pour les échantillons liquides plus complexes. La nature chimique de la phase solide est un des éléments clés de cette méthode puisqu’elle détermine la sélectivité de l’extraction (Fang et Qian, 2005 ; Lopez et al., 2007). Les phases les plus utilisées pour l’analyse des composés volatils odorants présents à l’état de traces dans les vins sont celles à base de divinylbenzene (DVB), carboxen (CAR) et polydimethylsiloxane (PDMS) ou celles à base de polydimethylsiloxane (PDMS) et divinylbenzene (DVB). L’affinité des composés volatils pour ces polymères sera modulée par

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le pH de l’échantillon, la présence de sels pouvant augmenter la volatilité, mais aussi par la propriété des polymères à adsorber les composés de polarités variées.

Dans le cadre de l’analyse des composés volatils, la technique d’extraction SPME est souvent couplée avec une méthode séparative telle que la chromatographie en phase gazeuse. Ainsi, après la phase d’extraction, la fibre est désorbée dans l’injecteur chauffé à haute température (entre 240 et 270°C) pour que les composés volatils soient séparés par chromatographie en phase gazeuse. D’autre part, cette technique d’extraction est aussi utilisée pour la CPG-O (Gürbüz et al., 2006). Cette approche peut cependant présenter des inconvénients car la SPME est une extraction sélective et la quantité de zones odorantes sera donc réduite.

C’est une méthode simple avec, pour avantage majeur, l’absence d’utilisation de solvant. De plus, elle peut être utilisée pour de faibles volumes d’échantillons (Lopez et al., 2007).

2. Méthodes de séparation et d’identification des composés volatils

a) La chromatographie en phase gazeuse (CPG)

La chromatographie en phase gazeuse est une méthode séparative parmi les plus employées pour l’étude des composés volatils odorants du vin. Elle permet d’analyser qualitativement et quantitativement des mélanges complexes de composés volatils ou de composés qui peuvent être volatilisés (Etiévant, 1987). Les composés sont séparés selon leur point d’ébullition et la différence des coefficients de partage entre la phase stationnaire et le gaz vecteur. Ces mécanismes de séparation sont dépendants de la polarité de la phase stationnaire. Sur colonne polaire, les composés sont séparés selon leur polarité et leur température d’ébullition ; sur colonne apolaire, ils sont séparés selon leur température d’ébullition. Enfin, les composés sont détectés en sortie de colonne grâce à des détecteurs, soit non spécifiques comme le FID (Détecteur à ionisation de flamme), soit spécifiques comme le détecteur FPD pour les composés soufrés ou le détecteur NPD pour les composés azotés. Pour l’étude des composés odorants du vin, la CPG est souvent couplée à l’olfactométrie et/ou la spectrométrie de masse.

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b) Détection des zones odorantes par Chromatographie en phase

gazeuse couplée à l’olfactométrie (CPG-O)

La chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie (O), aussi appelée CPG-sniffing, est basée sur l’évaluation sensorielle de l’éluat de la colonne chromatographique (Etievant, 1987). Le nez humain étant plus sensible que la plupart des détecteurs physiques, cette technique permet de détecter les zones odorantes les plus intéressantes et de les associer à des temps de rétention.

Pour avoir des résultats quantitatifs, certaines méthodes sont utilisées comme les techniques CHARM (Combined Hedonic Aroma Response Measurement) et AEDA (Aroma Extract Dilution Analysis) basées sur le seuil de perception de dilutions successives de l’extrait brut et la durée du stimulus pour la méthode CHARM (Grosch, 1994 ; Ullrich et Grosch, 1987 ; Acree

et al. 1984). Le dégustateur indique les moments où il détecte l’odeur et donne la description de cette odeur. Les difficultés rencontrées avec ces deux techniques sont d’une part la mesure objective de l’intensité de l’odeur, d’autre part la pertinence de la réponse du dégustateur. Une méthode basée sur les fréquences de détection en fonction du nombre de fois où le composé est détecté (NIF : Nasal Impact Frequency) et une autre méthode basée sur le nombre de détections et la durée des sensations (SNIF : Surface of Nasal Impact Frequency) sont également proposées dans la littérature ; ces techniques ont aussi leurs limites car, pour que les résultats soient cohérents, il faut avoir un panel de 8 à 10 évaluateurs sélectionnés pour leurs aptitudes sensorielles.

La CPG-O peut également estimer les concentrations des composés volatils. Cette approche est souvent complétée par les techniques les plus sensibles et les plus sélectives comme la CPG couplée à la spectrométrie de masse (Pollien et al., 1999).

c) Identification des zones odorantes par Chromatographie en phase

gazeuse bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse et à l’olfactométrie (CPG-CPG-SM-O)

Le vin est une matrice complexe et le manque de résolution des analyses par CPG-SM peut compromettre la qualité de l’identification d’un composé ou de sa quantification. Aussi, la

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chromatographie bidimensionnelle semble être une bonne alternative comme aide à la résolution de problèmes analytiques associés à la complexité de la matrice.

Elle est plus résolutive que la CPG-O pour les composés présents à l’état de traces dans une matrice complexe (Herrero et al., 2009). La CPG multidimensionnelle peut être couplée à l’olfactométrie et la spectrométrie de masse. Elle consiste en un couplage de deux colonnes chromatographiques ayant des mécanismes de séparation différents, avec un transfert partiel des composés séparés sur la première colonne vers la seconde colonne, pour que les performances de séparation de chacune des colonnes soient préservées (système heart-cutting). Chaque colonne est contenue dans un four. Elles communiquent par l’intermédiaire d’une « pièce croix » permettant de réguler la pression entre les deux colonnes et d’une ligne de transfert où la température est contrôlée. Grâce à cette méthode, on peut mettre en évidence les molécules qui seraient co-éluées en CPG monodimensionnelle. Cependant, en dépit du pouvoir résolutif de cette technique, une étape de pré-purification de l’extrait brut est parfois indispensable pour réussir l’identification des composés odorants présents à l’état de traces (Pons et al., 2008b ; Stamatopoulos et al., 2014). La CPG-CPG couplée à l’olfactométrie ainsi qu’à la spectrométrie de masse doit donc pouvoir faciliter l’identification de composés volatils clés.