Méthodes analytiques

II.2.1 Le suivi de la concentration en biomasse

II.2.1.1 Suivi spectrophotométrique

Le suivi de la densité bactérienne est assuré par une mesure de turbidimétrie à 600 nm (DO600nm). La concentration bactérienne augmente proportionnellement avec la turbidité de la solution à analyser mais reste toujours très faible atteignant au maximum 0.1 dans les cultures en Erlenmeyers en milieu minéral pour Nitrosomonas europaea et Nitrobacter winogradksyi.

II.2.1.2 Mesure du poids sec

Afin d’estimer la concentration bactérienne massique lors de cultures, des mesures de poids sec sont réalisées. Comme les bactéries nitrifiantes ont un faible taux de croissance et n’atteignent que de faibles concentrations même après plusieurs jours/semaines de culture, il est difficile de mesurer le poids sec. Cependant, lors de cultures en bioréacteurs où les concentrations bactériennes sont plus élevées ces mesures sont réalisables. Pour les cultures de Cupriavidus pinatubonensis, les mesures de poids sec ont facilement été réalisables.

Des tubes de 50 mL sont préalablement séchés à 110 °C puis pesés, après une mise à température ambiante dans un dessiccateur. On note M0 la masse du tube après la pesée initiale. On ajoute 50 mL de suspension bactérienne dont la densité optique a été mesurée au préalable. Les tubes sont centrifugés 20 minutes à 10000 g. Après la centrifugation, le surnageant est éliminé et les tubes ouverts sont replacés au four à 110 °C. Après 72 h, les tubes sont pesés après une mise à température ambiante dans un dessiccateur. On note M1, la masse du tube après la seconde pesée. La soustraction M1-M0 donne la masse sèche de bactéries contenues dans les 50 mL de solution initiale. On peut alors en déduire une concentration massique bactérienne. Cette concentration est rapportée à la densité optique mesurée initialement afin d’établir une corrélation DO600nm/concentration massique.

II.2.2 Le suivi des composés azotés

Les composés azotés peuvent être dosés en utilisant des techniques différentes. Des dosages colorimétriques permettent de doser les ions ammonium et nitrite. Un appareillage de chromatographie ionique peut servir à titrer les ions ammonium, nitrite et nitrate. La concentration en urée a été mesurée par un kit fourni par Megazyme®.

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II.2.2.1 Les dosages colorimétriques

II.2.2.1.1 Titration de l’ammonium

Les ions ammonium sont dosés selon la réaction de Berthelot, (Patton, and Crouch, 1977) ; ils réagissent avec la javel et le phénol pour former un complexe bleu détectable à 570 nm. 50 µL d’échantillon est mélangé à 500 µL de javel, 500 µL de phénol nitropussiate et 3 mL d’eau distillée. Les tubes sont passés au vortex et placés à l’obscurité pendant une heure. Une gamme étalon de 0 à 80 mg NH4⁺/L est réalisée à partir d’une solution de NH4Cl à 80 mg NH4⁺/L.

II.2.2.1.2 Titration du nitrite

Les ions nitrite sont dosés selon la méthode de GRIESS (Keeney and Nelson, 1982). Le nitrite forme, avec le réactif de GRIESS, un complexe rose détectable à 540 nm. 50 µL de réactif de GRIESS sont ajoutés à 1mL d’échantillon et les tubes sont incubés 2 minutes à l’obscurité avant de lire la DO à 540 nm. Une gamme étalon de 0 à 80 mg NO2^-/L est préparée à partir d’une solution NaNO2 à 80 mg NO2^-/L.

II.2.2.1.3 Titration de l’urée

Le dosage de l’urée est réalisé selon la méthode décrite par Knorst et al, 1997. Ce dosage colorimétrique repose sur l’utilisation du p-dimethylaminobenzaldéhyde (DMBA) de formule C9H11NO. Ce réactif va entraîner la formation d’un composé jaune par dérivatisation de l’urée. Le réactif du dosage est composé de 4 % (w/v) de DMBA et 4 % (w/v) d’acide sulfurique dans de l’éthanol absolu (Knorst et al., 1997). 0.5 mL de cette solution est ajouté à 2 mL d’échantillon et l’absorbance à 422 nm est lue après 10 min d’incubation. Une gamme étalon est réalisée à chaque dosage, Figure II-1 :

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Figure II-1: Courbe étalon du dosage de l'urée selon Knorst et al, 1997.

Ce dosage est réalisé sur des échantillons déproténéisés (Partie II.2.2.2.2) et dilués de manière à ce que l’absorbance lue se trouve dans la gamme de la courbe étalon.

II.2.2.2 La chromatographie ionique

II.2.2.2.1 Principe

Connue sous le nom de résine échangeuse d’ions, la chromatographie ionique permet de doser différents ions dans une solution. Pour doser des cations tels que les ions ammonium, une colonne chargée négativement est utilisée. Pour doser le nitrite et le nitrate, une colonne chargée positivement est utilisée. L’interaction entre les ions et la résine de la colonne étant différente pour chaque ion, ces derniers sont élués par la phase mobile et répondent à des temps différents pour chaque espèce dosée. La détection est réalisée par conductimétrie. Grâce à un étalonnage de l’appareil, il est alors possible d’avoir une détermination précise de la concentration de chaque ion dans l’échantillon testé.

La chromatographie ionique utilisée pour ces analyses est une 882 Compact IC plus fournie par Metrohm®.

II.2.2.2.2 Préparation des échantillons

Les échantillons doivent être déproténéisés et filtrés sur 0.22 µm avant d’être injectés dans la chromatographie cationique. La déproténéisation est réalisée en ajoutant 125 µL de baryte de sodium 0.3 M et 125 µL de sulfate de zinc à 3 %, à 1 mL d’échantillon. L’ensemble est passé au vortex et centrifugé pendant 5 minutes à 10000 g avant d’être filtré à 0.22 µm.

y = 0,0028x R² = 0,9957 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0 20 40 60 80 100 120 DO 4 2 2 n m Concentration en urée (mg/L)

87 II.2.2.2.3 Dosage des cations

Les cations sont dosés avec une colonne à résine négative Metrosep C450, Metrohm®. La phase mobile est composée d’acide nitrique 65 % à une concentration finale de 117.5 µL/L d’éluant, et d’acide dipicolinique à une concentration finale de 0.117 g/L. La boucle d’injection présente un volume de 100 µL, et il est nécessaire d’injecter 1.5 mL d’échantillon pour une analyse.

II.2.2.2.4 Dosages des anions

Les anions sont dosés avec une colonne à résine positive Metrosep A Supp 5, Metrohm®. La phase mobile est composée de bicarbonate de sodium à 0.084 g/L et de carbonate de sodium à 0.339 g/L. La boucle d’injection présente un volume de 20 µL, et il est nécessaire d’injecter 1 mL d’échantillon pour une analyse.

II.2.2.3 La Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)

Durant les cultures de C. pinatubonensis, l’HPLC a permis de déterminer les concentrations en acétate dans les échantillons. La chaîne utilisée est composée de deux colonnes d’exclusion ionique en série (Phénomenex® Rezex ROA 300 x 7.8 mm). Les colonnes sont placées dans un four à 50 °C, et l’éluant est une solution à 2 mM d’acide sulfurique dans de l’eau ultra-pure. L’éluant est dégazé à l’entrée de l’appareil et circule à un débit de 0.7 mL/min. La détection des composés est assurée par un réfractomètre (HP série 1100). L’acquisition et l’intégration des résultats sont réalisées grâce au logiciel ChemStation (Agilent®, USA). L’injection des échantillons est automatisée et ceux-ci doivent être traités avant analyse comme pour l’analyse par Chromatographie Ionique (Partie II.2.2.2.2).