Description des souches utilisées

II.1.1 Souches

Deux souches bactériennes ont été sélectionnées pour faire fonctionner le compartiment 3 de la boucle MELiSSA. La nitrosation est assurée par Nitrosomonas europaea ATCC®

19718™ et Nitrobacter winogradskyi ATCC® 25931™ est la bactérie nitratante choisie. Ces souches sont conservées sur billes et congelées à -80 °C. Des cultures liquides sont réalisées et maintenues afin d’avoir à disposition les deux bactéries. En effet, N. europaea et N. winogradskyi ne poussent pas sur gélose. Les cultures liquides sont alors maintenues axéniques et sont repiquées régulièrement.

La souche Cupriavidus pinatubonensis est conservée sur gélose TSA (Tryptic Soy Agar). La souche est aussi maintenue en culture liquide dans du milieu Luria Bertani (LB).

II.1.2 Milieux de culture

II.1.2.1 Nitrosomonas europaea ATCC® 19718

Le milieu de Nitrosomonas europaea est le milieu ATCC® #2265 décrit dans le Tableau II-1. Les trois solutions sont préparées et la solution 2 est ajustée à pH=8 avec du NaOH 10 N. La solution 1 est filtrée sur un filtre Millipore® 0.22 µm et les solutions 2 et 3 sont combinées puis filtrées.

Tableau II-1 : Milieu de culture ATCC® #2265 pour Nitrosomonas europaea.

Solution 1 (NH4)2SO4 4.95 g Solution 2 KH2PO4 8.2 g KH2PO4 0.62 g NaHPO4 0.7 g MgSO4 0.27 g Eau distillée 0.3 L CaCl2 0.04 g Solution 3 Na2CO3 0.6 g FeSO4 0.5 mL Eau distillée 12 mL CuSO4 0.2 mg

Eau distillée 1.2 L

II.1.2.2 Nitrobacter winogradskyi ATCC® 25931

Nitrobacter winogradskyi peut croître en milieu minéral, milieu ATCC® #480 composé de 6 solutions différentes et décrit dans le Tableau II-2.

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Tableau II-2 : Milieu de culture ATCC® #480 pour Nitrobacter winogradskyi.

Préparation de la solution intermédiaire Volume de solution pour 1 L milieu final Solution A CaCl2 20 g/L 0.5 mL Solution B MgSO4, 7H2O 200 g/L 0.5 mL Solution C EDTA 0.14 g 1 mL FeSO4, 7H2O 0.5 g H2SO4 0.05 mL Eau distillée 100 mL Solution D Na2MoO4, 2H2O 0.1 g 0.5 mL MnCl2, 4H2O 0.2 g CoCl2, 6H2O 2 mg ZnSO4, 7H2O 0.1 g CuSO4, 5H2O 0.02 g Eau distillée 1 L Solution E NaNO2 414 g/L 0.5 mL Solution F K2HPO4 17.4 g/L 2 gouttes

Eau distillée 1 L

Les solutions sont mélangées et la solution finale est stérilisée par autoclave à 121 °C et 1 bar pendant 20 min.

Le milieu de croissance riche fourni par la compagnie allemande Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ®) est le milieu DSMZ® #756, et a été modifié en ajoutant du NaNO2 à 2 g/L afin d’avoir une source de nitrite dans le milieu.

Tableau II-3 : Milieu riche #756 pour Nitrobacter winogradskyi.

Préparation de la solution intermédiaire

NaNO2 2 g

Extrait de levure 1.5 g

Peptone 1.5 g

Na-pyruvate 0.55 g

Solution éléments trace MnSO4, xH2O 33.8 mg 1 mL H3BO3 49.40 mg

ZnSO4, 7H2O 43.10 mg (NH4)6Mo7O24 37.10 mg FeSO4, 7H2O 97.30 mg CuSO4, 5H2O 25 mg

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Eau distillée 1 L

Solution stock CaCO3 0.07 g 100 mL NaCl 5 g

MgSO4, 7H2O 0.5 g KH2PO4 1.5 g Eau distillée 1 L

Eau distillée 899 mL

Après préparation, le milieu de culture est stérilisé à l’autoclave à 121 °C et 1 bar pendant 20 min.

II.1.2.3 Le milieu de coculture de N. europaea et N. winogradskyi

Pour les cocultures de N. europaea et N. winogradskyi, un milieu de coculture a été mis au point dans le cadre du projet MELiSSA (Montras et al., 2008). Ce milieu de culture est minéral et combine les milieux #2265 et #480 avec une source d’ammonium. La composition du milieu est décrite dans le Tableau II-4.

Tableau II-4 : Composition du milieu de coculture pour les cultures mixtes de

Nitrosomonas europaea et Nitrobacter winogradskyi.

(NH4)2SO4 1.32 g/L CaCl2, 2H2O 0.74 mg/L KH2PO4 0.68 g/L FeSO4, 7H2O 2.5 mg/L Na2HPO4 0.71 g/L CuSO4, 5H2O 4 µg/L (NH4)6Mo7O24, 4H2O 0.177 g/L NaHCO3 0.8 g/L ZnSO4, 7H2O 4.3 µg/L Rouge crésol 0.125 mg/L MgSO4, 7H2O 52 mg/L

Le milieu préparé est autoclavé pendant 20 min à 121 °C et 1 bar.

II.1.2.4 Cupriavidus pinatubonensis : milieu riche

La souche C. pinatubonensis est conservée sur gélose Trypto-caséine soja (TSA) à 4 °C, et cultivée dans un milieu LB de composition décrite dans le Tableau II-5:

Tableau II-5: Composition du milieu de culture LB pour Cupriavidus pinatubonensis.

Tryptone 10 g Chlorure de sodium 10 g Extrait de levure 5 g

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II.1.2.5 Cupriavidus pinatubonensis : milieu de coculture modifié

La souche C. pinatubonensis est aussi cultivée sur un milieu minéral : le milieu de coculture (décrit en II.1.2.3) où la source majoritaire de l’azote est l’urée. Ce milieu sera utilisé lors de culture en Erlenmeyer afin de tester la capacité de dégradation de l’urée par C. pinatubonensis tout en utilisant le CO2 comme source de carbone.

Tableau II-6: Composition du milieu de coculture modifié utilisé pour cultiver

Cupriavidus pinatubonensis.

CO(NH2)2 1.32 g/L CaCl2, 2H2O 0.74 mg/L KH2PO4 0.68 g/L FeSO4, 7H2O 2.5 mg/L Na2HPO4 0.71 g/L CuSO4, 5H2O 4 µg/L (NH4)6Mo7O24, 4H2O 0.177 g/L NaHCO3 0.8 g/L ZnSO4, 7H2O 4.3 µg/L Rouge crésol 0.125 mg/L MgSO4, 7H2O 52 mg/L

Le milieu préparé est autoclavé pendant 20 min à 121 °C et 1 bar.

II.1.3 Maintien des souches

Les cultures de Nitrosomonas europaea ATCC® 19718 et Nitrobacter winogradskyi ATCC®

25931™ sont difficiles et longues à mettre en œuvre. Ainsi, les pré-cultures ne sont pas réalisées juste avant l’ensemencement en bioréacteurs et sont maintenues toute l’année par repiquages réguliers. Les cultures de Nitrosomonas europaea ATCC® 19718 sont incubées dans des flacons en position horizontale à 28°C, à l’obscurité et sans agitation. Le pH est ajusté régulièrement à 7.5 - 8 à l’aide d’une solution de KOH 0.1 N. Les cultures sont repiquées au 1/20ème en moyenne toutes les 6 semaines quand les concentrations bactériennes obtenues permettent d’avoir une DO600nm après repiquage supérieure à 0.02. Les cultures de Nitrobacter winogradskyi ATCC® 25931 sont réalisées en Erlenmeyers et placées à 28 °C avec agitation et à l’obscurité. Des ajouts de nitrite (NaNO2 200 g/L) sont réalisés dès que le substrat est entièrement consommé. Ces ajouts peuvent être ponctuels ou fréquents (toutes les 48 h) selon l’âge de la culture. Le pH n’est pas modifié par cette étape de la nitrification, il n’est donc pas nécessaire de contrôler et d’ajuster le pH des précultures. Celles-ci sont repiquées au 1/20ème en moyenne toutes les 4 semaines quand les concentrations bactériennes obtenues permettent d’avoir une DO600nm, après repiquage, supérieure à 0.02.

Les cultures mixtes sont placées à 26 °C avec agitation et à l’obscurité. Le pH est contrôlé et ajusté à l’aide d’une solution de KOH 0.1 N. Les cultures sont repiquées au 1/20ème en

83 moyenne toutes les 6 semaines quand les concentrations bactériennes obtenues permettent d’avoir une DO600nm après repiquage supérieure à 0.02.

Cupriavidus pinatubonensis est conservée sur gélose TSA. Pour la préparation d’une culture liquide, une colonie est ensemencée dans 5mL de milieu LB. Au bout de 24 h, cette pré-culture est repiquée à 10 % dans 45 mL de milieu LB. L’opération est répétée de manière à obtenir le volume attendu de culture.

II.1.4 Cultures de Cupriavidus pinatubonensis

Des cultures pures de C. pinatubonensis ont été réalisées pour déterminer ses paramètres cinétiques et observer son métabolisme.

II.1.4.1 Détermination du taux de croissance maximum en microplaque

C. pinatubonensis présentant des taux de croissance élevés, sa croissance a été étudiée en microplaque afin d’avoir un grand nombre de réplicats. Dans une microplaque 96 puits stérile (ThermoFischer Scientific®, USA), est disposé 180 µL de milieu de culture LB (Partie II.1.2.4). Chaque premier puits de chaque colonne est utilisé comme témoin négatif. Les autres puits sont inoculés avec 20 µL d’une préculture de C. pinatubonensis. La microplaque est placée dans un incubateur-lecteur de plaque (Victo X3, PerkinElmer®, USA) contrôlé par ordinateur où la densité optique à 600 nm est relevée toutes les 30 minutes après agitation de la plaque et la température maintenue à 28 °C. Les données sont relevées pendant 24 h.

II.1.4.2 Observation du métabolisme en Erlenmeyers

Pour observer le métabolisme de C. pinatubonensis et vérifier notamment que la souche dégrade l’urée, des cultures en Erlenmeyers sont réalisées en parallèle. Les conditions testées sont les suivantes :

Tableau II-7: Protocole opératoire pour les cutlures en Erlenmeyers de C.

pinatubonensis.

Erlenmeyer A Erlenmeyer B Milieu de culture Milieu LB Milieu de coculture modifié

Agitation 100 rpm

Température 30 °C

Mesures réalisées Lecture DO600nm, Dosages urée, ammonium et acétate

Des prélèvements réguliers sont réalisés dans les deux Erlenmeyer pour comparer les croissances dans les deux conditions.

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