Méthode

3.2.1 Biotinylation de l’anatoxine tétanique

Chaque ampoule d’anatoxine tétanique contenait 900 unités Lf d’anatoxine (1 unité Lf est la quantité de toxine ou d’anatoxine tétanique nécessaire pour faire floculer 1 unité internationale d’anti-tetani) et 50 mg de glycine (la masse moyenne contenue dans une ampoule est de 0,0631 g de substance desséchée ± 0,38 %). Pour commencer 10 mg (environ 2 mg d’anatoxine) du contenu de l’ampoule ont été solubilisés dans 1 mL de tampon carbonate (pH 9,6) et ont été dialysés pour éliminer la glycine. La biotinylation de l’anatoxine se fait grâce à la réaction entre le groupement carboxylique de la biotine et les amines libres présentes au niveau du polypeptide pour former une liaison amide, il est donc nécessaire d’éliminer les amines comme la glycine.

Pour la biotinylation de l’anatoxine tétanique, 10 mg de N-hydroxysuccinimidobiotine ont été solubilisés dans 400 µL de diméthylsulfoxyde (DMSO) lesquels ont ensuite été additionnés à la solution dialysée d’anatoxine (en solution tampon carbonate pH 9,6). Après 2 h d’incubation à température ambiante et sous légère agitation, la solution est dialysée contre 4 fois 1 L de PBS pour éliminer la biotine restée libre.

3.2.2 Immobilisation de l’anatoxine tétanique

Les MPM couvertes de streptavidine ont été utilisées pour immobiliser l’anatoxine tétanique biotinylée (Figure 48A). La procédure d’immobilisation suivie est fournie par le fabricant :

Procédure de lavage :

1. Remise en suspension des MPM streptavidinées, en évitant la formation de mousse, en pipetant ou en vortexant

61 2. Transvasement du volume désiré de MPM au moyen d’une pipette dans un tube

Eppendorf

3. Placement du tube sur le dispositif magnétique pendant 1 min pour piéger les MPM

4. Elimination du surnageant en le prélevant soigneusement à la pipette et éliminé, les MPM sont laissées dans le tube

5. Remise en suspension des MPM dans le volume original avec le tampon d’immobilisation en retirant le tube du dispositif magnétique

Procédure d’immobilisation :

1. Lavage deux fois des MPM avec le tampon d’immobilisation et ensuite remises en suspension dans le tampon d’immobilisation dans le volume original donnant une concentration de 10 mg/mL.

2. Ajout de la molécule biotinylée et incubation à température ambiante pendant 30 min sous légère agitation.

3. Placement du tube sur le dispositif magnétique pendant 1 min.

4. Prélèvement à la pipette et élimination du surnageant, les MPM sont laissées dans le tube.

3.2.3 Procédure de blocage

Les particules couvertes par l’anatoxine ont été remises en suspension dans une solution de BSA (3 % m/v) et incubées 1 h à température ambiante sous une légère agitation. Le tube est ensuite placé sur le dispositif magnétique de telle sorte que les particules restent dans le tube et que le surnageant soit éliminé. Les MPM ont été rincées trois fois avec PBS et remises en suspension dans le volume original de PBS. La même procédure a été utilisée pour les autres solutions de blocage (Figure 48B).

3.2.4 Immunoessais

Toutes les réactions ont été réalisées dans un tube de type Eppendorf. Une procédure similaire à un essai immunologique de type sandwich a été adoptée pour la détermination du titre en anticorps anti-tetani. En effet, l’IgG anti-tetani est prise en sandwich entre l’antigène

62 immobilisé et le second anticorps. Ce dernier est un anticorps dirigé contre les IgG de cobaye et marqué par la peroxydase de raifort. Un volume de 10 µL de MPM a été ajouté à 100 µL de solution contenant le sérum anti-tetani de cobaye (sérum lyophilisé remis en solution dans du PBS). Après 15 min d’incubation à température ambiante, les MPM ont été séparées du surnageant grâce à un aimant et remises en suspension dans 100 µL de solution contenant l’anti-IgG de cobaye conjugué à la peroxydase de raifort (1/100). Après 45 min d’incubation, les particules ont été séparées par piégeage magnétique et le surnageant a été éliminé. Les MPM ont été lavées deux fois dans 0,5 mL de tampon de lavage. Finalement le tube a été placé sur le dispositif magnétique pour que les immunoparticules soient retenues et le surnageant éliminé. Les MPM ont été remises en suspension dans 10 µL ou 80 µL de tampon citrate pH 5,5 additionné de peroxyde d’hydrogène 2 mM pour la détection ampérométrique avec le système à trois électrodes classiques (10 µL) ou avec les SPE (80 µL). Les immunoparticules pour les essais à blanc ont été obtenues en réalisant les immunoréactions en l’absence d’antitoxine tétanique (Figure 48C et D).

3.2.5 Détection électrochimique

Deux systèmes de détection ont été étudiés : une cellule à trois électrodes classique et une tigette d’électrodes sérigraphiées (cSPE). Le système classique etait composé d’une électrode de référence Ag/AgCl NaCl 3 M, une électrode auxiliaire de platine et une électrode de travail magnétique à pâte de carbone (mCPE). Les électrodes ont été introduites dans 5 mL de tampon citrate en présence de peroxyde d’hydrogène 2 mM. Cet appareillage a été utilisé lors des étapes d’optimisation des paramètres tant immunologiques qu’ampérométriques. Un volume de 5 µL d’immunoparticules en suspension a été déposé à la surface de la mCPE. La mesure ampérométrique a été réalisée à potentiel constant (-250 mV). Dès que la ligne de base était stabilisée, l’hydroquinone a été introduite dans la cellule à une concentration finale de 2 mM. Le système utilisant une tigette d’électrodes sérigraphiées a été utilisé pour les essais réalisés sur sérum de cobaye. Cette dernière a été placée dans un support contenant un aimant exactement localisé sous l’électrode de travail. Un volume de 40 µL d’immunoparticules en suspension a été déposé à la surface des électrodes sérigraphiées (la quantité d’immunoparticules contenue dans ces 40 µL est équivalente à la quantité de billes contenue dans les 5 µL déposés à la surface de la mCPE). Ensuite, 10 µL d’hydroquinone ont été ajoutés aux 40 µL (concentration finale de 2 mM) et le courant cathodique a été enregistré à -280 mV. La même tigette a été utilisée pour tous les essais réalisés le même jour (Figure 48E).

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3.2.6 Voltampérométrie cyclique en présence d’immunoparticules immobilisées sur SPE.

Ces essais ont été réalisés en présence de MPM retenues à la surface des cSPE. Les billes ont été préparées en réalisant les immunoessais sur des dilutions du sérum anti-tetani de référence (A: 0,350 IU/mL, B: 0,175 IU/mL, C: blanc). Les immunoessais ont été réalisés selon la méthode décrite précédemment. L’essai à blanc a été réalisé dans les mêmes conditions mais en l’absence de sérum antitoxine. Les immunoparticules ont été remises en suspension dans 80 µL de tampon citrate et ensuite, un volume de 40 µL a été déposé à la surface de la tigette d’électrodes. La séquence de balayage en mode oxydation démarrait à 0 mV vers 800 mV et retour à 0. Le cycle de potentiel allait de 88 mV à -350 et revenait à 88 mV en mode réduction. La vitesse de balayage était de 10 mV/s. La même tigette a été utilisée pour toute une série d’essais. Elle a été rincée à l’eau et séchée entre deux essais.