Mécanismes de l’invasion

Une grande partie des travaux initiaux sur les mécanismes de l'invasion des GRH par le parasite paludéen a utilisé le parasite simien : Plasmodium knowlesi. Cette espèce a un cycle de vie érythrocytaire de 24 heures et de grands mérozoïtes envahissants à long terme, facilitant l'utilisation de la microscopie électronique et de la vidéo pour disséquer la dynamique de l’invasion des érythrocytes [88-90]. Le P. knowlesi peut être cultivé in vitro chez le singe rhésus (Macaca mulata), GRH avec rhésus ou sérum humain [90-92]. Particulièrement, le P. knowlesi se prête à la manipulation génétique, avec une efficacité rapportée de la transfection similaire à celle obtenue avec le modèle de paludisme à Plasmodium berghei des rongeurs, dépassant de loin les résultats obtenus chez P. falciparum [90, 92, 93]. P. knowlesi est phylogénétiquement et étroitement lié au Plasmodium vivax, la

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cause la plus importante du paludisme en dehors de l'Afrique [36, 90], de sorte que son étude peut fournir les aspects uniques de la biologie pour le P. vivax.

P. knowlesi pourrait fournir un modèle idéal in vitro pour le parasite du Plasmodium ; cependant, les tentatives précédentes pour adapter le P. knowlesi à la culture dans GRH ont échoué [90, 94], l'exigence d'une fourniture des GR des macaques et de sérum a restreint le travail sur ce parasite à de très peu laboratoires à travers le monde ayant l'accès aux installations des primates.

Une étude décrit l'adaptation d'une lignée de P. knowlesi à la culture en continu dans les GRH sans exigence des cellules ou de sérum de macaque. Fait important, la lignée conserve sa capacité d’infecter des cellules de macaque. Les clones dérivés de la lignée de P.knowlesi adaptée aux humains ont été utilisés dans un essai à base de FACS-format à 96 puits adapté à étudier l'importance des polymorphismes de la surface des GRH pour l’invasion parasitaire efficace et pour sa croissance. L’utilisation Spécifique de P.knowlesi nous démontre que le clone de P. knowlesi adapté à l'Homme est très bien prêt à la manipulation génétique, avec une meilleure efficacité de transfection 100.000 fois mieux par rapport à celui réalisé pour P. falciparum, et dépassant celui atteint par le P. berghei. Ceci fournit une occasion unique pour toutes les espèces de Plasmodium d'interroger les conséquences phénotypiques des modifications génétiques dans la première génération de parasite au stade sanguin asexué transgénique [71]. Cette étude est réalisée afin d’adapter les parasites du P.knowlesi à la culture continue dans les érythrocytes humains. Cette réalisation fournit aux chercheurs l'accès à certaines des caractéristiques uniques traitables du stade sanguin asexué de P. knowlesi, aussi à la biologie cellulaire appropriée pour étudier l'invasion des GRH et les interactions récepteur-ligand impliquées. L’analyse du processus d'adaptation lui-même permet de savoir plus sur les déterminants de la spécificité de l'hôte dans le paludisme [71].

Cette adaptation a été initiée par la culture in vitro d’une souche congelée A1, dérivée de la souche H du P.knowlesi. Les parasites ont été ajoutés par la suite aux GR des M.fascicularis fraîchement prélevées, la lignée culturale résultante a été nommée A1-O qui a été divisée à son rôle en deux cultures distinctes, une maintenue uniquement dans les GR

100% cynomolgues (appelé A1 humains et cynomolgue appelé A1 éliminées avec les taux de croissance à

résultante a été clonée, et en parallèle avec la lignée

A1-H.5, et A1-C.1 à A1-C.2 ont été produits par la suite. Les clones A1 sélectionnés pour une caractérisation détaillée

Figure 23: Stratégie utilisée pour adapter

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00% cynomolgues (appelé A1-C), l’autre a été maintenue dans un mélange e appelé A1-H (E), les cellules cynomologues ont été éliminées avec les taux de croissance à 100% dans les GR humains. Puis la lignée

en parallèle avec la lignée A1-C des clones parasitaires ont été produits par la suite. Les clones A1-H.1 sélectionnés pour une caractérisation détaillée (figure 23) [71].

Stratégie utilisée pour adapter la croissance des parasites dans les GRH

a été maintenue dans un mélange 4: 1 des GR H (E), les cellules cynomologues ont été entièrement . Puis la lignée A1-H parasitaires A1-H.1 à H.1 et A1-C.1 ont été

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Les comparaisons détaillées du génome des clones A1-H.1 et A1-C.1 sont déjà en cours (à la fois au niveau génomique et RNAseq). On prévoit qu’ils permettront d'identifier les déterminants génétiques ou épigénétiques nécessaires à la croissance dans GRH, représentant potentiellement le facteur de virulence important de P. knowlesi pour l'Homme. Un maintien étendu du Plasmodium en forme stade sanguin asexué est bien documenté qu’il perd la capacité d’établir les formes gamétocytes sexuées essentielles pour la transmission à travers les moustiques. En effet aucune lignée de culture adaptée ne semble capable de produire des gamétocytes. Les informations sur la séquence du génome peuvent aider à identifier les changements génétiques responsables de ceci, facilitant potentiellement la culture des gamétocytes produisant des lignées du P. knowlesi dans l'avenir [71].

Les chercheurs étaient en mesure de démontrer la nécessité de l'antigène Duffy dans le clone A1-H.1, les essais précédents d’un seul cycle de l’invasion dans GRH en utilisant les parasites de P.knowlesi des macaques infectés n’ont pas réussi à identifier un meilleur taux de l’invasion dans les cellules à Duffy positif Fy^b+, malgré la démonstration que le récepteur des GRH pour le parasite, Duffy binding protéine (DBP), se lie plus fortement au phénotype Duffy+ Fy^b+ que Fy^a+ des GRH. Ces expériences, menées avec un clone entièrement adapté à la culture, ont permis d'améliorer la sensibilité en raison des taux élevés et de multiples cycles de l’invasion, mais n’ont réussi à démontrer aucune différence Fy-dépendante du taux de croissance. Avec la mise en garde que les données provenant de l'utilisation d'un seul être humain adapté au clone de P. knowlesi, on suggère qu'il existe des différences fondamentales entre P. vivax et P. knowlesi, ou que l’effet récemment observé des polymorphismes Duffy sur l'incidence clinique de P. vivax peut être dû à une sensibilité accrue des GRH Fy^a+ à des anticorps bloquant l’invasion et dans certains cas allèle dosage, plutôt qu'un effet direct sur l'efficacité de l'invasion

Bien que le clone A1-H.1 a affiché une grande amélioration de l’invasion et des taux de croissance dans GRH par contre au stock A1 à partir du quel il est dérivé, il a maintenu la capacité de se développer bien dans les globules rouges de macaque, présentant souvent des taux de réplication légèrement plus élevés que dans GRH. Le fait que cette caractéristique a été conservée même après plusieurs mois de culture exclusivement dans les globules rouges

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humains, offre la possibilité passionnante de concevoir des expériences qui impliquent la navette entre les deux, macaques et cellules humaines in vitro. Des travaux antérieurs ont démontré qu'il est possible d'établir les infections in vivo chez les macaques rhésus à partir des parasites cultivés à long terme dans les globules rouges rhésus, les chercheurs visent à explorer si les clones A1-H (et mutants transgéniques de ceux-ci) peuvent être appropriés pour des expériences similaires. La capacité de combiner les expériences in vitro avec les études in vivo dans des modèles primates sera inestimable pour les enquêtes « pathogenèses » des parasites et pour le développement des vaccins, en particulier les vaccins pour le P. vivax, qui partage les voies d'invasion avec le P. knowlesi, mais manque d’un système de culture in vitro à long terme. Une vaste caractérisation in vitro des parasites utilisés pour des expériences in vivo des macaques permettra d'améliorer la valeur du travail in vivo [71].