O gene ESR1 é referido na literatura como possuidor de vários polimorfismos genéticos (Figura 3). Os polimorfismos no gene ESR1 podem ser responsáveis por diferentes variantes alélicas da proteína, podendo alterar a sua função e actividade, culminando em diferenças do efeito dos estrogénios sobre o desenvolvimento de doenças (Araújo et al., 2008) e sobre a eficiência reprodutiva (Corbo et al., 2007).
Os polimorfismos no gene ESR1 em humanos têm sido associados com desordens do sistema reprodutor masculino (Kukuvitis et al., 2002; Galan, et al., 2005;
Figura 2. Organização do gene receptor dos estrogénios α (ESR1) (Figura modificada de
Safarinejad et al., 2010) e feminino (Hsieh et al., 2007; Ayvaz et al., 2009; Cupisti et al., 2009), osteoporose (Langdahl et al., 2000; Gennari et al., 2005), doenças cardiovasculares (Mansur et al., 2005; Molvarec et al., 2007; Boroumand et al., 2009), desordens que envolvem o sistema nervoso central (Isoe-Wada et al., 1999; Brandi et al., 1999) e com neoplasias malignas (Speer et al., 2001; Tanaka et al., 2003; Gold et al., 2004).
1.6.1.1.1.1. O polimorfismo Pvu II e Xba I
Os polimorfismos Pvu II e Xba I devem o seu nome às enzimas endonucleases de restrição que os reconhecem, a Pvu II e a Xba I respectivamente. Estes polimorfismos são ainda conhecidos pelas designações de IVS1-397 T/C e IVS1-351 A/G ou rs2234693 e rs9340799, respectivamente.
Os polimorfismos Pvu II e Xba I (Figura 4) localizam-se no intrão 1 a cerca de 400 pb upstream do exão 2 e separados por aproximadamente 50 pb. O RFLP Pvu II detecta a substituição T-C na posição -397 upstream do exão 2 (T-397int1C), enquanto
Figura 3. Estrutura, domínios funcionais e polimorfismos descritos do gene ESR1. Os polimorfismos nos exões E1 a E8 apresentam a localização
do codão correspondente. Os polimorfismos intrónicos ESR1 351 XbaI A/G e ESR1 397 T/C estão indicados
T – timina; C – citosina; G – guanina; A – adenina (Figura modificada de Gennari et al., 2005)
o RFLP Xba I detecta a substituição A-G na posição -351 upstream do exão 2 (A- 351int1G) (Hall e Mc Donnell, 1999).
A actual nomenclatura usada para descrever os polimorfismos baseia-se na posição polimórfica apresentada por cada variante alélica. Deste modo, os alelos polimorfismo Pvu II são definidos como T e C denotando, respectivamente, a presença e a ausência do sítio de restrição. Na maioria das populações o alelo minor contém um C na posição polimórfica com uma frequência de cerca de 45%. Contudo, como esta variante alélica é bastante comum, em certas populações pode emergir como alelo major. Os alelos do polimorfismo Xba I são definidos como A e G referentes, respectivamente, à presença e à ausência do sítio de restrição e o alelo minor é o G que ocorre em cerca de 30 % dos indivíduos (Herrington e Howard, 2003).
Os alelos T e C do RFLP Pvu II são, também, referidos como p e P, respectivamente. Os alelos A e G do RFLP Xba I são comumente referidos como x e X, respectivamente. P e X são as variantes alélicas que não possuem o respectivo sítio de restrição de reconhecimento das enzimas Pvu II e Xba I (Herrington et al., 2002a).
Devido à sua proximidade, os polimorfismos IVS1-397 T/C e IVS1-351 A/G estabelecem um forte desequilíbrio de ligação um com o outro mesmo sendo a variante IVS1-351 menos comum. Numa população em desequilíbrio de ligação, algumas combinações alélicas ocorrem com mais frequência do que seria esperado da variabilidade aleatória. Como os polimorfismos Pvu II e Xba I estão em desequilíbrio de ligação, é possível prever o alelo de um polimorfismo conhecendo o alelo do outro polimorfismo (Herrington et al., 2002a).
Não existe efeito funcional ao nível molecular conhecido da transição A-G associada com a perda do sítio de restrição Xba I. No entanto, a transição T-C associada com a perda do sítio Pvu II resulta num potencial sítio de ligação para o factor de transcrição myb, que, na presença de Bmyb, é capaz de aumentar 10 vezes a transcrição in vitro de um gene repórter a jusante do polimorfismo. Em algumas ocasiões, então, a presença do alelo C deve amplificar a transcrição do ESR1. Em suma, o polimorfismo Pvu II tem impacto sobre a actividade dos estrogénios, influenciando a transcrição do gene ESR1 através da ligação deste a factores de transcrição modificados (Herrington et al., 2002b).
Os estudos recentes têm avaliado a distribuição dos polimorfismos ESR1 Pvu II e Xba I associados com a esterilidade masculina e feminina.
Nos homens, os polimorfismos Pvu II e Xba I têm sido associados com azoospermia e com a oligospermia severa (Kukuvitis et al., 2002; Suzuki et al., 2002).
Nas mulheres, os polimorfismos Pvu II e Xba I parecem influenciar parâmetros da fertilidade como a idade de menarca, idade de menopausa, aborto espontâneo e número de filhos (Stavrou et al., 2006; Corbo et al., 2007; Silva et al., 2010).
Investigações recentes apontam para uma associação entre polimorfismos Pvu II e Xba I e a esterilidade feminina inexplicada (Ayvaz et al., 2009; Du et al., 2011).
Os polimorfismos Pvu II e Xba I aparecem também associados ao aumento do risco de determinadas doenças ginecológicas associadas a esterilidade como a endometriose (Hsieh et al., 2007) e a falência ovárica prematura (POF) (Bretherick et al., 2008; Yoon et al., 2010).
Na literatura, é ainda referido que os polimorfismos Pvu II e Xba I podem influenciar a resposta ovárica e, consequentemente, a taxa de gravidez em paciente submetidas a estimulação da ovulação para tratamentos de fertilidade (Georgiou et al., 1997; Sundarrajan et al., 1999; Altmäe et al., 2007; Ayvaz et al., 2009; Loutradis et al., 2011).
IVS1-397 T C C C A G C T G -401 -400 -399 -398 -397 -396
IVS1-397 C C C C A G C C G T T T T A -401 -400 -399 -398 -397 -396 -395 -394 -393 -392 -391 Sítio de reconhecimento da enzima Pvu II
Sítio potencial de ligação da myb Sítio de clivagem Ausência do sítio de clivagem IVS1-351 A/G G G T C T A G A -346 -347 -348 -349 -350 -351 -352 -353 IVSI-351 A/G G G T C T G G A -346 -347 -348 -349 -350 -351 -352 -353 Sítio de clivagem
Sítio de reconhecimento da enzima Xba I
Ausência do sítio de clivagem
A B
Figura 4. Sequência humana de DNA genómico na região dos polimorfismos ESR1 IVS1-397 T/C
(Pvu II) (A) e ESR1 IVS1-351 A/G (Xba I) (B). (Figura modificada de Herrington e Howard, 2003)
O presente estudo pretende efectuar um estudo de associação entre os Pvu II e Xba I e a resposta ovárica em pacientes submetidas a estimulação da ovulação para PMA no Serviço de Reprodução Humana dos Hospitais da Universidade de Coimbra.
A resposta ovárica das pacientes às gonadotrofinas é muito variável e difícil de prever. O número de folículos que se desenvolve durante a estimulação influencia o número de embriões disponível para a transferência, selecção e criopreservação, assim como a possibilidade de gravidez (Tomas et al., 1997).
A existência de uma associação entre polimorfismos do gene ESR1 e a qualidade da resposta ovárica à estimulação com gonadotrofinas poderá constituir um marcador de susceptibilidade e permitir uma intervenção terapêutica mais adequada e personalizada.
Deste modo, os objectivos definidos para o presente trabalho foram:
- Determinar frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos Pvu II e Xba I na população em estudo.
- Determinar a associação dos polimorfismos Pvu II e Xba I com a resposta à estimulação ovárica.
- Determinar a associação dos polimorfismos Pvu II e Xba I com as diferentes causas de esterilidade feminina.
- Avaliar a correlação dos polimorfismos Pvu II e Xba I com a esterilidade devida a causas ovulatórias.