La m´ ethode du bootstrap

Os métodos enzimático-químicos para análise da ―fibra da dieta‖ utilizam enzimas para a isolarem e depois recorrem à análise química dos componentes dos polissacáridos do resíduo para a quantificarem. Nestes métodos podemos distinguir, entre outros, o método inicialmente desenvolvido em UPPSALA (THEANDER eAMAN,1979)e o método de ENGLYST (ENGLYST e CUMMINGS,1984 citados por ENGLYST e CUMMINGS,1988). Em muitos aspectos os métodos de UPPSALA e de ENGLYST seguem metodologias semelhantes e os seus desenvolvimentos recentes aproximaram-nos (ASP et al.,1992). Basicamente, estes métodos são constituídos por quatro fases: 1) Dispersão e hidrólise do

amido, 2) precipitação dos NSP solúveis, 3) hidrólise ácida dos NSP e 4) determinação dos monómeros constituintes dos NSP. Quando a amostra contém mais de 6% (método de UPPSALA)ou 10% de gordura (método de ENGLYST)também é prevista a sua remoção inicial, utilizando éter de petróleo (THEANDER et al.,1994)ou acetona(ENGLYST et al.,

1994).

Dado que os métodos de UPPSALA e de ENGLYST quantificam a fibra da dieta pela determinação dos seus monómeros constituintes, em ambos os métodos é essencial remover a totalidade do amido presente na amostra para que a sua glucose não seja determinada como pertencente às glucanas da parede celular. Com esta finalidade, no método de UPPSALA é utilizada uma -amilase bacteriana termo-estável (TERMAMYL) a 96ºC durante 30 minutos seguida de amiloglucosidase durante 16 horas a 55ºC em tampão acetato (pH 5;THEANDER eAMAN,1979; THEANDER, 1991; THEANDER et al.,

1995). Nas primeiras versões do método de ENGLYST (ENGLYST eCUMMINGS,1988)é prevista a solubilização do amido com dimetilsulfóxido (DMSO) seguida de incubação com as enzimas -amilase pancreática e pululanase em tampão acetato (pH5,2)durante

ca 16h a 42ºC (ENGLYST eCUMMINGS,1988). Nas versões mais recentes deste método

(ENGLYST et al., 1992, 1994), após a aplicação do DMSO é utilizada a TERMAMYL durante 10 minutos a 96ºC, seguida da -amilase pancreática e da pululanase, 30 minutos a 50ºC (ENGLYST et al.,1992,1994).

A TERMAMYL, que foi aplicada pela primeira vez no método de UPPSALA (THEANDER e AMAN, 1979), permite uma remoção eficaz do amido sem degradar os polissacáridos das parede celular (THEANDER et al., 1989), pelo que hoje em dia é utilizada em diversos métodos de medição da fibra da dieta, como o método oficial da AOAC de PROSKY e no método de ENGLYST (ENGLYST et al., 1992, 1994, 1996).Como já referimos, a utilização da TERMAMYL também é prevista numa versão recente do método das soluções detergentes (JERACI e VAN SOEST, 1990, referidos por VAN SOEST et al., 1991).

A concentração de monossacáridos, dissacáridos e oligossacáridos (açúcares) nos grãos de cereais é ca de 20 a 30 g.kg-1 (KNUDSEN, 1997). Nas leguminosas, ou produtos

delas derivados, o teor destes açúcares pode ser 4 a 5 vezes mais elevado, sendo formados sobretudos pelos -galactosideos rafinose, estaquiose e verbascose (CARRÉ et

al., 1984a; KNUDSEN, 1997). Os métodos enzimático-químicos, excluem estes açúcares

da fibra da dieta mesmo quando eles não são digestíveis, como ocorre com os

-galactosídeos. Esta exclusão é facilitada pelo facto dos açúcares serem solúveis em água e em etanol a 80% (v/v) enquanto que os NSP solúveis em água não são solúveis neste etanol. Na presença do etanol a 80%, os componentes de fibra da dieta solúveis em água, constituídos por polímeros com 11 ou mais monossacáridos ficam insolúveis e precipitam, juntando-se ao resíduo da amostra para posterior determinação dos NSP (SOUTHGATE, 1981; THEANDER e WESTERLUND, 1986; ENGLYST eCUMMINGS, 1988). Os açúcares, entendidos como monossacáridos, dissacáridos e oligossacáridos até 10 monómeros, mantêm-se solubilizados e, após a centrifugação, podem ser rejeitados com o etanol sobrenadante (SOUTHGATE, 1981; THEANDER e WESTERLUND, 1986; ENGLYST e CUMMINGS, 1988). Nos métodos de UPPSALA e de ENGLYST, o etanol a 80% (v/v) é aplicado após a hidrólise e dispersão do amido (ENGLYST et al., 1992, 1994;THEANDER et al., 1994, 1995).

Após a remoção da glucose resultante da hidrólise do amido e dos açúcares livres solubilizados – em geral obtida por centrifugação seguida de decantação ou aspiração do sobrenadante – os polissacáridos estruturais presentes no resíduo são sujeitos a hidrólise ácida (hidrólise de SAEMAN),para libertação dos açúcares ácidos e neutros (ENGLYST, 1989; AMAN e GRAHAM, 1990). A hidrólise de SAEMAN apresenta diversas variantes que dão resultados semelhantes (MARLETT, 1989). No método de ENGLYST e CUMMINGS (1988) é usado o ácido sulfúrico 12 M durante 1 h a 35ºC para dispersar a celulose e depois ácido sulfúrico 1M em banho de água fervente durante 2 h. Em versões mais recentes deste método (ENGLYST et al., 1992, 1994) é usado com ácido sulfúrico 12 M

durante 1 h a 35ºC e depois ácido sulfúrico 2M em banho de água fervente durante 1 h. No método de UPPSALA é usado ácido sulfúrico 12 M durante 1 h a 30ºC e depois ácido sulfúrico 0,4M a 125ºC durante 1 h (THEANDER et al., 1994, 1995). Se a dispersão inicial da celulose com o H2SO4 12 M for omitida realizando-se apenas a hidrólise com H2SO4 1 M durante 2 h, somente os polissacáridos não celulósicos (NCP) serão hidrolisados, podendo o valor da celulose ser obtido por diferença entre os NSP totais e os NCP

(ENGLYST eCUMMINGS, 1988; ENGLYST et al., 1992, 1994).

Os açúcares neutros obtidos pela hidrólise ácida de SAEMAN são depois medidos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC; MARLETT, 1989; ENGLYST et al.,

1994) ou por cromatografia líquida gasosa (GLC) após a derivatização (os monossacáridos são reduzidos com acetilação) em acetatos de alditol (ENGLYST e CUMMINGS, 1988; THEANDER, 1991; THEANDER et al., 1994, 1995; ENGLYST et al.,

1992, 1994). A análise dos ácidos urónicos por GLC é mais difícil que a dos açúcares neutros (THEANDER e AMAN, 1979) pelo que, em geral, são analisados usando métodos colorimétricos (ENGLYST e CUMMINGS, 1988; ENGLYST et al., 1992, 1994) ou por

descarboxilação (THEANDER e WESTERLUND, 1986; THEANDER, 1991;THEANDER et al., 1989, 1994). O uso da colorimetria na quantificação dos ácidos urónicos (geralmente o método de carbazole e suas modificações) apresenta o inconveniente de ser sensível à interferência dos monossacáridos neutros e de compostos como fenóis e proteínas (THEANDER e AMAN, 1979; ASP et al.,1992). Segundo ASP et al.(1992), no método de ENGLYST estes problema é diminuído pela aplicação do procedimento de SCOTT na quantificação dos ácidos urónicos, que utiliza o reagente 3,5-dimetilfenol. Dado que os equipamentos necessários para a medição dos ácidos urónicos pelo procedimento colorimétrico de SCOTT são mais comuns nos laboratórios que os necessários para a medição por descarboxilação, este procedimento também foi adoptado na versão mais recente do método de UPPSALA (THEANDER et al., 1995).

O teor em monossacáridos e em polissacáridos da fibra da dieta (NSP totais) é calculado usando um factor de correcção para cada monossacárido com a finalidade de corrigir as perdas ocorridas durante o processo de hidrólise, os rendimentos da derivatização e a resposta da GLC (THEANDER e WESTERLUND, 1986; ENGLYST e CUMMINGS, 1988; ASP et al.,1992).

No método de ENGLYST também podem ser obtidos valores para o conjunto dos polissacáridos totais por colorimetria com dinitrosalicilato quando informação detalhada sobre a composição dos monómeros não é necessária (ENGLYST e CUMMINGS, 1988; ENGLYST et al., 1994). No entanto, nos alimentos com teores elevados em ácidos urónicos este método pode subestimar os teores em NSP, pelo que pode ser aconselhável a medição dos ácidos urónicos em separado e a aplicação de factores de correcção ao teor

em NSP, em função dos teores nestes ácidos (ENGLYST et al., 1994).

Nos métodos de UPPSALA e de ENGLYST também podem ser determinados os NSP solúveis e insolúveis. Todavia, a metodologia seguida é diferente.

No método de UPPSALA,após o tratamento da amostra com TERMAMYL e com amiloglucosidase em tampão acetato (pH 5) é omitida a precipitação dos polissacáridos solúveis com o etanol a 80% e a amostra é centrifugada. O sobrenadante obtido por decantação é dialisado e liofilizado para obter um resíduo onde serão analisados os NSP solúveis e os NSP insolúveis serão analisados no resíduo sedimentado da amostra (THEANDER e AMAN, 1979; SALOMONSSON et al., 1984; THEANDER e WESTERLUND, 1986).

No método de ENGLYST, são realizadas duas análises em paralelo, uma para os NSP totais e outra para os NSP insolúveis, sendo osNSPsolúveis determinados como a diferença entre estas duas fracções. Para determinar os NSP insolúveis, após a aplicação das enzimas -amilase pancreática e pululanase a amostra é tratada em solução tampão fosfato a pH 7 e a 100 ºC durante 1 h (ENGLYST eCUMMINGS, 1988) ou 30 minutos (ENGLYST et al., 1992, 1994), seguindo-se depois idêntica metodologia à aplicada para a

determinação dos NSP totais.

O método de UPPSALA caracteriza a fibra da dieta como a soma dos polissacáridos ácidos e neutros e da lenhina de Klason (THEANDER e AMAN, 1979; THEANDER e WESTERLUND, 1986; THEANDER et al., 1994). A lenhina KLASON é gravimetricamente medida como ―resíduos não glucídicos‖, obtidos depois de tratamento da amostra com H2SO4 12 M (THEANDER e WESTERLUND, 1986; THEANDER et al., 1994). Na lenhina

KLASON estão também incluídos proteína da parede celular, produtos de MAILLARD nos alimentos sujeitos a tratamentos térmicos, complexos taninos-proteína e outros componentes não glucídicos (MARLETT, 1989).

No método de ENGLYST a lenhina não é determinada, correspondendo a fibra da dieta apenas aos polissacáridos estruturais (ENGLYST eCUMMINGS, 1988;ENGLYST et al.,