La linéarité de la réponse en analyse de masse

Au cours de notre développement de la stratégie N-TOP, nous disposions au laboratoire d’instruments de type trappe d’ions (Bruker) et d’un instrument de type Q-TOF (Synapt HDMS, Waters). Il était donc évident pour nous de choisir d’effectuer nos analyses sur l’instrument de type Q-TOF pour bénéficier de la résolution apportée par cet instrument (20000). Or nous nous sommes rendu compte en travaillant avec des protéines modèles que la gamme dynamique de cet instrument est très restreinte. En effet, cet instrument est équipé d’un détecteur MCP avec un digitaliseur de type TDC (« Time to Digital Converter »). Le digitaliseur a pour rôle de convertir les signaux électriques enregistrés par le détecteur en valeurs digitales, ici en l’occurrence, convertir les courants mesurés en spectres de masse. Un digitaliseur TDC est un module qui fournit une représentation digital des évènements (pulsations, courants) enregistrés en fonction du temps. La saturation d’un digitaliseur TDC par un signal intense se traduit par des erreurs de mesure de masse, de résolution et d’intensité. Pour cet instrument, cette saturation est observée à partir d’une dynamique de détection de l’ordre de 10 au dessus du seuil de détection d’un composé. Ceci se traduit, en plus de l’erreur de mesure de la masse (déplacement du pic vers la gauche) par de fortes erreurs sur la mesure des ratios des intensités de deux peptides homologues (qui eux sont détectés simultanément). Il s’est donc avéré que ce spectromètre de masse n’est pas le mieux adapté pour une quantification avec une stratégie de dilution isotopique telle que qN-TOP.

Les instruments de type trappe d’ions présentent une gamme dynamique plus étendue que le Synapt HDMS. En effet, la quantité d’ions accumulés dans la trappe peut être contrôlée. Dès que cette quantité définie est atteinte, les ions accumulés sont éjectés et la trappe recommence un cycle de mesure. Si cette quantité n’est pas atteinte dans un temps prédéfinis par l’utilisateur (de l’ordre de 100 ms), la trappe éjecte quand même les ions et recommence un cycle. Ceci fait que la trappe n’est jamais saturée et aucune saturation spectrale n’est atteinte. Cependant, un des inconvénients majeurs de ce type d’instrument est sa faible résolution. Ceci va entrainer des problèmes d’interférence très importants qui

vont pénaliser la justesse de la quantification. Ceci sera discuté plus en détail dans le chapitre 4 de la partie III.

A la fin de l’année 2010, le laboratoire a fait l’acquisition d’un instrument de type Q-TOF de dernière génération (MaXis, Bruker). Cet instrument affiche une résolution de 60000 et une gamme dynamique largement plus étendue que les instruments de génération antérieure. Cet instrument est équipé d’un détecteur de type ADC (Analog to Digital Converter) ou Convertisseur Analogique-Numérique. Ce détecteur travaille à une fréquence de digitalisation de 4 GHz. Un ADC, comme son nom l’indique, a pour rôle de convertir un signal analogique (dans notre cas l’intensité issue du détecteur) en une valeur numérique. L’association de cette valeur numérique au signal analogique est réalisée par intégration du signal sur une période d’échantillonnage qui correspond à l’inverse de la fréquence de digitalisation. Chaque période correspond à un temps de vol qui permet de calculer le m/z. A chaque fenêtre de temps de vol est ainsi associée une valeur d’intensité. Dans un balayage donné, l’ensemble des intensités intégrées associé à chaque fenêtre de m/z est sommé pour constituer une intensité totale en fonction du m/z associé au temps de vol et former ainsi un spectre de masse. La précision de ce processus est limité par l’erreur de quantification [10]. En effet, lorsque l’intensité issue du détecteur est supérieure au dernier niveau d’intensité encodé, l’ADC est à saturation et associera sa valeur d’intensité limite maximale. Le signal aura un sommet aplati. Ceci se traduit donc par une erreur sur l’intensité du signal. Cependant, la gamme dynamique de détection du MaXis de Bruker est plus étendue que celle du Synapt HDMS de Waters, elle est évaluée à 3 logs par le constructeur.

Nous avons d’abord évalué au laboratoire la gamme dynamique linéaire du MaXis en injectant des quantités croissantes d’un mélange de peptides trypsiques et en suivant l’intensité de deux ions différents. Cette expérience a montré que la réponse est linéaire sur une gamme étendue sur deux décades. Nous avons ensuite évalué la linéarité avec des peptides marqués au TMPP lourd et léger. Pour ce faire, nous avons effectué des mélanges d’une protéine modèle (chaine α de l’hémoglobine) marquée avec les deux formes de TMPP (léger et lourd) avec des ratios léger/lourd allants de 0,1 jusqu’à 100. Chaque solution correspondant à un ratio léger/ourd a été injectée trois fois afin d’évaluer la reproductibilité. Les résultats sont visibles sur le graphique de la figure 4. On observe que les ratios mesurés pour chaque mélange sont reproductibles avec des écarts types inférieurs à 3 %. D’autre part, on observe une réponse linéaire jusqu’au ratio 20. Au-delà de ce ratio, une déviation significative des ratios expérimentaux est observée par rapport aux ratios théoriques. La gamme linéaire est donc limitée à un ratio de 20 contrairement a ce qui a été obtenu dans la première expérience où nous avons eu une réponse linéaire sur une gamme de 2 logs. Ceci peut être expliqué d’une part par le fait que dans le cas d’une détection simultanée (peptides marqués au TMPP lourd et léger) la gamme linéaire est plus restreinte que dans le cas de l’injection de quantité croissante d’un peptide donné. D’autre part, la préparation des mélanges de peptides marqués léger et lourd nécessite des dilutions successives pour les ratios élevés ce qui peux introduire des erreurs sur ces ratios.

Ces résultats montrent que le MaXis présente en plus de sa résolution qui va de paire avec la précision de mesure de masse, une gamme dynamique linéaire compatible avec l’application de la stratégie TOP. La gamme dynamique de linéarité de cette stratégie qN-TOP est comparable avec celles reportées pour les autres stratégies de quantification (1 à 2 logs) avec marquage chimique isotopique (ICPL, ICAT, …) dans la littérature [11]. Il est cependant à noter que dans une expérience de quantification de modifications post-traductionnelles tel que le taux d’un clivage protéolytique, le calcule du ratio d’abondance est basé sur une seule observation (1 seul peptide) ce qui peut induire des erreurs de quantifications contrairement aux expériences de quantification de niveau d’expression des protéines où le plusieurs peptides contribuent au calcul du ratio d’abondance de leurs protéines correspondantes.

Figure 4 : Evaluation de la reproductibilité, justesse et linéarité de mesure des ratios d’abondance de deux peptides modèles homologues marqués par le TMPP léger et le [¹³C₉]-TMPP.

5. Conclusion

Cette dimension quantitative ajouter à la stratégie N-TOP permet une quantification relative des peptides N-terminaux et donc de comparer les taux de protéolyse entre deux échantillons biologiques. Ceci permettra d’élucider un nombre de mécanismes cellulaires, d’identifier des substrats de protéase et d’effectuer des études de dégradomique afin d’apporter des réponses à certaines questions biologiques. Cette méthode a l’avantage de conserver les peptides internes par rapport aux autres stratégies d’analyse des clivages

0,1 1 10 100 0,1 1 5 10 100 5 20 20 50 50 0,5 0,5

Ratio théorique léger/lourd Ratio expérimental léger/lourd

Valeurs expérimentales (trois répétitions) Valeurs théoriques

protéolytiques décrites dans le chapitre 4 de la partie I. De plus, elle est plus simple à appliquer puisqu’une seule étape de dérivation est ajoutée au protocole d’analyse protéomique. Il est cependant important d’accorder une attention particulière au choix du spectromètre de masse et au paramétrage instrumental pour les analyses LC-MS/MS. Une première application est décrite dans le chapitre 3 de la partie III dans le cadre d’une étude du jeûne prolongé chez le rat.

Chapitre 3 Apport du marquage avec un