Les trois grandes stratégies d’analyse protéomique quantitative par spectrométrie de masse

Nous avons vu dans ce chapitre les principales techniques de quantification en analyse protéomique. Ces techniques peuvent être utilisées dans différentes stratégies d’analyse protéomique en fonction de la problématique biologique posée. Les stratégies de quantification en analyse protéomique par spectrométrie de masse peuvent être réparties en trois classes comme proposé par Domon et Aebersold [189]: Les stratégies « shotgun » ou découverte, les stratégies basées sur la MS dirigée ou pilotée (« directed MS ») et les stratégies basées sur la MS ciblée (« targeted MS »).

4.1. Les stratégies « shotgun » ou découverte

Les stratégies dites de découverte consistent à analyser par LC-MS/MS le digest d’un protéome d’intérêt en mode données dépendant (DDA). Le spectromètre de masse effectue des cycles de balayage MS et MS/MS en continu générant un grand nombre de spectres MS/MS qui servent par la suite à séquencer les peptides afin de les identifier. La sélection des peptides pour la MS/MS se fait de manière heuristique lors des balayages MS. La quantification va de pair avec l’identification dans ce type de stratégies, elle est effectuée dans « la foulé » à l’aide des données MS (méthodes SILE) ou MS/MS (par exemple : iTRAQ, spectral counting). La précision des données de quantification de ces stratégies est limitée. Ces stratégies sont souvent utilisées de façon qualitative dans le but d’identifier un grand nombre de protéines dans un échantillon complexe. Etant donné qu’aucune connaissance préalable des protéines contenues dans l’échantillon n’est nécessaire, ces stratégies sont bien adaptées pour la réalisation d’expériences de découverte générale. La limitation principale de cette méthode est dans le biais induit par la nature heuristique du procédé de sélection des ions précurseurs et la sélection préférentielle des ions les plus abondants. Ceci est d’autant plus accentué lorsqu’il s’agit d’échantillons complexes dans lesquels le nombre des analytes est beaucoup plus important que la capacité de pic du système LC-MS induisant des résultats d’identification peu reproductibles [189].

4.2. Les stratégies basées sur la MS dirigée

Les stratégies basées sur la MS dirigée consistent à effectuer des analyses en deux temps. Dans un premier temps, une première analyse LC-MS ou LC-MS/MS est effectuée afin de sélectionner les éléments pour constituer une liste d’inclusion. Les informations collectées dans cette première analyse sont utilisées pour construire l’analyse du même échantillon dans un second temps. Ces stratégies sont donc moins biaisées par la sélection heuristique et préférentielle des composés les plus abondants. L’utilisation de la liste d’inclusion permet de cibler un ensemble d’ions d’intérêt. De plus, la dissociation des étapes d’identification et de quantification permet d’obtenir des données de quantification plus fiables [189].

4.3. Les stratégies de MS ciblée

Dans les stratégies dites de MS ciblées, la construction de l’expérience est basée sur des informations et des données issues d’expériences préalables. La méthode la plus souvent utilisée dans ce type de stratégie est la SRM. Ces stratégies ciblent donc un ensemble de protéines ou de peptides d’intérêt particulier. Les détails du déroulement des expériences de SRM sont décrits dans le paragraphe 3.5 de ce chapitre. Parmi toutes les stratégies de quantification en analyse protéomique, les stratégies de MS ciblée permettent d’obtenir les quantifications les plus précises et les plus reproductibles. De plus ces stratégies sont les plus sensibles et possèdent les limites de détection et les limites de quantification les plus faibles [189].

4.4. Les facteurs clés à prendre en compte dans la construction d’une expérience de protéomique quantitative

Lors de la réalisation d’une étude protéomique quantitative, plusieurs facteurs clés doivent être considérés. L’importance à accorder à chacun de ces facteurs dépend du type de résultats recherchés [189]. Ces facteurs sont au nombre de six:

 La sélectivité : c’est la capacité d’une méthode à identifier et quantifier un analyte particulier dans un échantillon complexe sans interférence avec les autres composés présents dans l’échantillon.

 La limite de détection (LOD): la LOD d’une méthode est la quantité minimale d’un analyte donné capable d’être détectée avec fiabilité. La limite de quantification étroitement liée à la LOD est définie comme étant la quantité minimale d’un analyte permettant sa quantification avec fiabilité. LOD et LOQ dépendent non seulement de la méthode et des propriétés physico-chimiques de l’analyte mais aussi de la complexité de la matrice dans laquelle il se trouve.

 La gamme dynamique : la gamme dynamique d’un instrument est la gramme d’intensité entre le signal le plus intense et le signal le moins intense d’un analyte dans une seule et même analyse.

 La densité des données : c’est le nombre de mesures acquises dans une expérience. Dans une analyse « shotgun » c’est le nombre de spectres MS/MS qui ont conduit à

des identifications. Dans une expérience MS dirigée ou MS ciblée, c’est le nombre de peptides analysés et quantifiés.

 La répétabilité : C’est l’aptitude d’une méthode à générer des résultats identiques pour des échantillons identiques analysés dans les mêmes conditions.

 La reproductibilité : c’est l’aptitude à obtenir des résultats identiques pour des échantillons identiques analysés par la même méthode mais dans des conditions différentes (expérimentateurs différents, appareils différents, …).

La figure 6 représente ses six facteurs sur six axes sur lesquels les caractéristiques des trois stratégies décrites ci-dessus sont reportées.

Figure 6 : Profils des performances classées selon 6 axes représentant les 6 facteurs clés de la quantification en analyse protéomique. (A) pour la stratégie « shotgun » ou découverte, (B) pour la stratégie MS dirigée et (C) pour la stratégie MS ciblée (adaptée de [189]). Sélectivité Gamme dynamique LOD Répétabilité Reproductibilité Densité des données Sélectivité Gamme dynamique LOD Répétabilité Reproductibilité Densité des données Sélectivité Gamme dynamique LOD Répétabilité Reproductibilité Densité des données A) B) C) Forte complexité Faible complexité Forte complexité Faible complexité Forte complexité Faible complexité

Chapitre 4 L’analyse des sites de clivage