La liaison variable comme observatoire de la variation en français

Neste estudo, a dose de 0,5mg/kg de Maleato de Enalapril não ocasionou diminuição significativa na PAM em bovinos. Diferentemente do que foi apresentado por Barros (2015), que observaram diminuição significativa da PAM em fêmeas da raça Girolando, com doses de 0,4 e 0,5 mg/kg. Os mesmos autores, quando utilizaram a dose de 0,4mg/kg em fêmeas Nelore, não obtiveram diferença em relação ao grupo tratado com placebo Barros (2015), considerando que a pressão arterial média em bovinos oscila entre 90 a 120 mm/hg, em condições fisiológicas de normotermia (LIN e WALZ, 2014).

Visto que a indicação terapêutica usual do Maleato de Enalapril visa o controle sistêmico da PAM em pacientes hipertensos Bonagura e Stepien (2008), acreditamos que em pacientes normotensos, tais quais as fêmeas bovinas utilizadas em nosso experimento, a supressão do sistema renina-angiotensina- aldosterona não atue na mesma magnitude, visto que ainda não está totalmente esclarecido o seu efeito anti-hipertensivo mediado pelo bloqueio da degradação de Ang II, um potente vasopressor peptídico (BEDOGNA et al., 1990; BROWN et al., 1998).

Bedogna et al. (1990) também relataram que o mesmo não provocou efeito sobre o SRA, assim como na diminuição da PAM, em humanos, considerados normotensos, tratados com Benazepril corroborando com os resultados observados nesse estudo. Contudo, em nosso estudo, a vascularização uterina foi significativamente menor nos animais tratados.

Bollwein et al. (2004) observaram que o uso do inibidor da ECA, captopril, aumenta o fluxo sanguíneo útero-ovariano em éguas, o que pode, segundo os autores, acarretar um maior fluxo de gonadotrofinas, fatores de crescimento e nutrientes.

Receptores de Ang II estão presentes nas células da teca e granulosa em bovinos Portela (2008), e há aumento nos níveis de Ang II no folículo dominante durante o desvio folicular (FERREIRA, 2011). Além disso, resultados revelam que folículos pré-ovulatórios expressam RNAm para enzimas que clivam Ang I e Ang II em Ang-(1-7) (TONELLOTO DOS SANTOS, et al, 2012). Outros autores relataram que, em mulheres, a Ang-(1-7) pode agir como um importante regulador do fluxo

sanguíneo, isto devido ao aumento da expressão da ECA2 e dos níveis plasmáticos e urinários de Ang-(1-7), provavelmente devido à neutralização dos feitos da Ang II pela ECA2, aumentando a taxa de conversão para Ang-(1-7) (BROSNIHAN et al., 2004). Também foi descrita a presença de Ang-(1-7) em ovários de ratas, mostrando concentrações mais elevadas na fase de pré-ovulatória (COSTA et al., 2003). Isto justifica a maior vascularização nos folículos pré-ovulatórios (D11) de fêmeas tratadas com Maleato de Enalapril.

A alta correlação entre os valores absolutos do número de pixels e área de vascularização de todas as estruturas do trato reprodutivo feminino, avaliadas, demonstra que a pontuação subjetiva da extensão da perfusão vascular foi eficientemente validada com base na intensidade de pixels coloridos das imagens, como já descrito em éguas e novilhas (SILVA et al., 2005; GINTHER, 2007).

Em suma, o modo Doppler é uma ferramenta de investigação que permite avaliar o fluxo sanguíneo dos vários componentes do aparelho reprodutivo e fornecer informação relativa ao estado fisiológico deste durante as várias fases do ciclo reprodutivo (HERZOG e BOLLWEIN, 2007).

Não houve efeito do tratamento no diâmetro folicular. No protocolo de sincronização todos os animais receberam suplementação exógena de E2, o que pode ter implicado na não significância entre tratamentos, tanto no crescimento folicular quanto nas concentrações de E2. De qualquer modo, sabe-se que a P450aromatase atua na conversão de Testosterona em 17ß-estradiol e aumenta ao longo do desenvolvimento folicular final, diminuindo em folículos atrésicos (BAO, et al., 1997).

O maleato de enalapril aumentou a taxa de ovulação em vacas Nelore sincronizadas para ovulação única (P=0,04), resultado também encontrado em fêmeas bovinas da raça Nelore (Barros, 2015) e caprinas da raça Boer (Feitosa, 2010), ambas superestimuladas com FSH.

A correlação positiva e mediana entre o diâmetro do folículo dominante e os valores absolutos de pixels e a área de vascularização, deve-se ao estágio de desenvolvimento folicular, já que quanto maior o folículo e maior seu aporte hormonal, maior será o fluxo sanguíneo ali presente.

A inibição da produção de Ang II por captopril, outro inibidor da ECA que apresenta meia vida mais curta que o enalapril, não alterou a ovulação de ratas

imaturas estimuladas com PMSG/hCG, nem em ovários de coelhas perfundidos in vitro, sugerindo que a produção local de Ang II não seria essencial para o processo ovulatório (DAUD, et al., 1990 e YOSHIMURA, et al., 1994). Os mecanismos potenciais que poderiam explicar a falta de efeito do captropril sobre a ovulação incluem a geração de outros fragmentos de Ang por diferentes vias de formação sem a participação da ECA. Um desses fragmentos é a Ang-(1-7), que é formada a partir de AngI e a AngII, através da ECA2, que não é inativada pelo captopril (DONOGHUE, et al., 2000).

A Ang-(1-7) está presente em ovários de ratas e a sua concentração é variável durante o ciclo estral, onde as concentrações mais altas são observadas no proestro e estro (COSTA, et al., 2003). Observou-se também aumento da produção de estradiol e progesterona, assim como da taxa de ovulação em ovários de coelhas perfundidos in vitro com Ang-(1-7) (VIANA et al., 2011). Outras pesquisas demonstraram ainda a participação desse peptídeo na ovulação, maturação ovocitária e esteriodogênese (COSTA et al., 2003; VIANA et al., 2011; HONORATO-SAMPAIO et al., 2012).

No presente estudo, o tratamento com maleato de enalapril não apresentou efeito sobre as concentrações séricas de progesterona e estradiol no líquido folicular, nem sobre o diâmetro e vascularização do corpo lúteo e concentração de progesterona sérica no diestro subsequente. Estes resultados são semelhantes ao encontrado por (PEREIRA et al., 2015; BARROS, 2015).

Bollwein et al. (2016), relata que durante o período de pré-ovulatório, existe uma relação funcional entre o fluxo sanguíneo do folículo e as concentrações de estradiol e a LH é descrito. Antes do pico de LH, o fluxo sanguíneo é detectável apenas em uma pequena área na base do folículo, mas paralelamente ao desenvolvimento folicular há aumento nas concentrações de E2 no plasma e fluxo detectável (ACOSTA et al. 2003).

O aumento no fluxo de sanguíneo para o folículo pré-ovulatório é suporte para aumentar a oferta de gonadotrofinas e facilitar a ruptura e consequentemente ovulação (ACOSTA et al., 2007).

A identificação de fólicos pré-ovulatórios e folículos atrésicos em estágio inicial, pode ser realizada através da verificação do fluxo sanguíneo ali presente,

pois folículos pré-ovulatórios, são bem vascularizados, enquanto que folículos atrésicos tem uma vascularização baixa (ACOSTA, et al., 2003).

Concomitantemente as medições de fluxo sanguíneo folicular por ultrassonografia com Doppler colorido pode ser usado para identificar folículos em desenvolvimento normal e prever a proximidade da ovulação, assim como a associação entre a presença e a concentração de fluxo sanguíneo folicular e E2 respectivamente, já que o E2 causa uma rápida dilatação dos vasos sanguíneos, aumentando a biodisponibilidade de óxido nítrico (PANCARCI et al., 2012). Frequentemente, o folículo dominante da primeira onda folicular ovariana não só tem um diâmetro folicular maior e esteroidogênese superior ao folículo dominante da segunda onda, mas também um fluxo sanguíneo maior (MIURA et al., 2014).

Em ovários de coelhas perfundidos in vitro com Ang-(1-7), houve comprovado aumento de E2 e P4, tal qual ocorre quando a ECA é bloqueada (VIANA, et al., 2011).

A presença da Ang-(1-7) na esteroidogênese foi descrita previamente no modelo de ovários de ratas perfundidos in vitro, onde esse peptídeo induziu um aumento na síntese de estradiol e progesterona (COSTA, et al., 2003; VIANA, et al., 2011) . Ainda nesse estudo, o A-779, antagonista específico do receptor MAS, foi capaz de bloquear a esteroidogênese induzida pela Ang-(1-7). Além disso, o A-779 foi capaz de reduzir significativamente a síntese de progesterona induzida pelo LH em folículos pré-ovulatórios, indicando que essa gonadotrofina estimula a síntese de progesterona em parte através do receptor MAS (HONORATO-SAMPAIO, et al., 2012).

Vários estudos também demonstraram que Ang II estimulou a produção de estradiol em diferentes modelos e espécies (COSTA et al., 2003; YOSHIMURA, et al., 1993; PUCELL, et al., 1987; JOHNSON, et al., 1997). Um dos principais efeitos farmacológicos dos inibidores de ECA é diminuir a concentração de Ang II, isso devido a interrupção da principal via de produção, a conversão de AngI em AngII pela ECA. Na pesquisa de Costa et al. (2003), a Ang II apresentou efeito estimulante sobre a produção de estradiol e progesterona. Porém, quando o A-779 foi utilizado em combinação com Ang II, foi verificada uma inibição apenas na síntese de progesterona. Contudo, a síntese de estradiol permaneceu inalterada. Tais

resultados sugerem que a ação da Ang II sobre a produção de progesterona é devido à sua conversão em Ang-(1-7).

Na avaliação entre a razão progesterona/estradiol, o maleato de enalapril não causou efeito significativo, diferindo do pressuposto inicial da participação da Ang-(1- 7) na síntese de progesterona. Independentemente do mecanismo pelo qual a Ang- (1-7) age sobre a esteroidogênese ainda ser desconhecido, já foi relatado que esse peptídeo ativa a via IP3K/Akt através do receptor MAS em diferentes tipos celulares (GIANI, et al., 2007; SAMPAIO, et al., 2007). Ryan et al. (2007), descreveram o papel da Akt na diferenciação das células da granulosa, apontando a participação dessa via no controle da esteroidogênese. Os mesmos autores, em uma publicação posterior, concluíram que as gonadotrofinas induzem a fosforilação da Akt das células da teca/granulosa e que o inibidor de Akt (LY294002) é capaz de inibir a esteroidogênese in vitro e in vivo em bovinos (RYAN et al., 2008).

Apesar de o maleato de enalapril ter aumentado significativamente a expressão gênica da enzima P450aromatase, conforme já discutido anteriormente, acreditamos que a suplementação exógena com 1 mg de benzoato de estradiol no protocolo de sincronização se sobrepôs à produção endógena, considerando que a meia-vida plasmática deste fármaco pode ser de até 70–114 horas após administração (Rourke et al. 2000); (Vynckier et al. 1990) , fazendo com que as concentrações de E2 fossem similares entre os animais tratados e não tratados. Ademais, segundo (Yapura et al. 2012), ocorre diminuição significativa nas concentrações de estradiol entre 12 e 24 horas após a administração de inibidor de aromatase em novilhas. Baseado nos resultados desses autores, sugerimos que o aumento no estradiol plasmático pode ser notadono mínimo 12 horas após a expressão de P450 aromatase nas células da granulosa.

Já é estabelecido na literatura que, em bovinos, há expressão de RNAm da enzima P450aromatase em células da granulosa de folículos com diâmetro à partir de 4mm. Fisiologicamente, a expressão desta enzima se eleva com o desenvolvimento folicular e cai significativamente em folículos atrésicos (BAO et al., 1997). Silva e Prince (2000), em um estudo in vitro com células da granulosa de bovinos cultivadas, demonstraram que o FSH possui a capacidade de aumentar tanto a produção de estradiol quanto a expressão do RNAm da P450 aromatase.

Uma característica interessante do efeito da FSH sobre a expressão da aromatase é o longo tempo necessário para o FSH para induzir RNAm para aromatase (24 a 48 horas) (FITZPATRICK e RICHARDS, 1991).

Além da P450aromatase, houve efeito do maleato de enalapril sobre a expressão de genes associados ao SRA local, ocasionando aumento da expressão da enzima ECA2 e diminuição do receptor MAS. Em nosso estudo buscamos mostrar a expressão do receptor MAS e de uma das principais enzimas que atuam na conversão para Ang-(1-7) nas células de folículos pré-ovulatórios em bovinos, a ECA2. Com isso, observou-se que animais tratados com Enalapril, obtiveram um aumento na expressão gênica para ECA2, que tem a capacidade de formar Ang-(1- 7) a partir de Ang I e a partir de Ang II e que não é inativada por fármacos inibidores da ECA como o captopril (DONOGHUE et al., 2000). O aparecimento dessa enzima em diversos compartimentos ovarianos sugere a produção de Ang- (1-7) (PEREIRA, et al., 2015). Com a presença de ECA2 no líquido folicular é provável que esse peptídeo desenvolva em bovinos as mesmas funções já vistas em outras espécies, como estimular a produção de estradiol e progesterona, ovulação, e maturação oocitária (COSTA et al., 2003; VIANA et al., 2011; HONORATO-SAMPAIO et al., 2012). Dentre estes, o principal evento observado em nosso estudo, foi o aumento na taxa de ovulação, resultado este observado também por (BARROS, 2015).

Além do aumento da ECA2, o tratamento com Enalapril diminuiu a expressão gênica do receptor MAS, reforçando que houve, de fato, alta produção de Ang-(1- 7), já que este receptor é específico para esta angiotensina Santos et al. (2003) e suas ações são especificamente inibidas quando o receptor MAS é bloqueado por seu inibidor A-779 (DILAURO e BURNS, 2009).

Esta resposta foi pela primeira vez esclarecida por Gironacci et al. (2011), que investigaram a hipótese de que o receptor MAS pode ser internalizado e dessensibilizado sob estimulação com Ang- (1-7), pois a Ang- (1-7) é o ligante endógeno para o receptor MAS acoplado à proteína G e que ambos podem se internalizar para garantir a regulação molecular e homeostase (SANTOS et al., 2003; HANYALOGLU e ZASTROW, 2008; SORKIN e ZASTROW, 2009 ). Neste ocorreu, a diminuição da expressão de RNAm para o receptor MAS, possivelmente

uma consequência esperada após o tratamento com inibidor de ECA maleato de enalapril.

O papel da Ang-1-7 na ovulação ainda não é totalmente esclarecido, mas sabe-se, que a mesma exerce alguns dos seus efeitos biológicos através da liberação de mediadores tais como cininas Brosnihan et al.(1996), prostaglandinas (TRACHTE et al., 1990; JAISWAL et al., 1993; MUTHALIF et al., 1998) e óxido nítrico (PORSTI et al., 1994; LI et al., 1997). Em nosso estudo, a taxa de ovulação foi significativamente maior no grupo tratado, sugerindo uma possível interação entre a Ang-(1-7) e o processo ovulatório (VIANA, et al., 2011)

Além disso, a Ang-(1-7) está envolvida na vasodilatação e facilita o fluxo sanguíneo sistêmico Brosnihan et al. (1996) e, também, está associada ao aumento do fluxo arterial durante a gestação (NEVES et al., 2003).

Foi também demonstrado que a expressão de RNAm para MAS e para a ECA2 aumenta em homogenatos de ovário de ratas tratadas com eCG (PEREIRA et al., 2009). Isso sugere também uma possível função da Ang-(1-7) a partir de um estímulo por gonadotrofina (TONELLOTTO DOS SANTOS et al., 2012). Entretanto, mais estudos são necessários para entender como expressão ECA2 é regulada em células da granulosa e quais são os seus efeitos sobre o desenvolvimento folicular em bovinos (BARRETA et al., 2014).

Diante do contexto abordado nas pesquisas citadas, e em consonância com os resultados obtidos neste estudo, evidenciou-se que o maleato de enalapril exerce influência sobre os sistemas locais controladores das atividades útero- ovariana e que ainda há necessidade de se realizar novas pesquisas para elucidar os seus efeitos na expressão de genes associados ao desenvolvimento folicular, na competência oocitária, na taxa de ovulação e subsequente no desenvolvimento embrionário, principalmente em bovinos, cuja importância econômica é significativa.