INTRODUCTION GENERALE
III LE CADRE METHODOLOGIQUE
III- 1 Les méthodes d’analyse
O presente trabalho teve como objectivo o estudo de dois membros das OMPs de H.
pylori, hopM e hopN, mais concretamente o estudo da sua diversidade genética, evolução e
a avaliação da sua associação com a patologia gástrica e com marcadores moleculares de virulência de H. pylori, nomeadamente com os genes cagA e vacA.
Foram estudadas 234 estirpes clínicas e 23 estirpes de referência isoladas de doentes de origem geográfica diferente e apresentando diversas gastropatologias. Em todas as estirpes foi identificada pelo menos uma cópia de um destes genes no seu genoma, o que sugere a existência de pressão selectiva para serem mantidos na bactéria, como já foi descrito para outros genes codificantes de OMPs, tais como homA/homB, babA/babB, sabA e oipA [99,104,120].
A análise de ambos os genes revelou diversidade tanto relativamente ao número de cópias de cada gene como à sua localização genómica. Esta diversidade não foi associada à patologia da qual a estirpe foi isolada, mas mostrou especificidade geográfica, havendo uma diferença clara entre as estirpes de origem oriental e as de origem ocidental, à semelhança do que foi descrito para outros factores de virulência de H. pylori [63,64,88,121- 123]. Na população ocidental todos os genótipos possíveis de hopM/hopN foram identificados (cópia única ou dupla cópia, do mesmo gene ou genes diferentes), enquanto na população asiática apenas os genótipos de cópia única foram observados. Curiosamente, na população africana apenas foram identificados os genótipos de dupla cópia, embora dado o número reduzido de estirpes analisadas, não se possa concluir se este resultado reflecte uma tendência desta população, ou não. Vários estudos apontam para que a variação no número de cópias de genes que codificam OMPs, esteja implicada na adaptação da bactéria a hospedeiros específicos, sendo um factor crucial para o desenvolvimento de uma infecção crónica e persistente [56,100,120]. Assim, sugere-se que a especificidade geográfica no número de cópias hopM/hopN reflicta igualmente o papel destes genes neste processo adaptativo.
O facto de estes genes terem demonstrado uma elevada similaridade tanto ao nível da sequência de nucleótidos (Tabela 2) como na sequência de aminoácidos, especialmente na região 5’ e 3’ (Tabela 2, segmentos 1 e 3), sugere a possibilidade de ocorrência de fenómenos de recombinação intra e intergenómica, que podem levar a duplicação, delecção ou conversão génica entre hopM e hopN, como resposta a variações ambientais. A presença de uma ORF mais pequena no locusN de todas as estirpes asiáticas e de algumas estirpes ocidentais, sugere que nestes casos o gene foi perdido, deixando um remanescente que pode possibilitar a sua integração novamente no genoma, tal como foi sugerido para
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outros genes codificantes de OMPs de H.pylori (homA/homB, babA/babB) [64]. Curiosamente, estas proteínas putativas mais pequenas correspondem nas estirpes ocidentais à região alélica (segmento 4) e no caso das estirpes asiáticas à fusão do péptido sinal de hopM/hopN com a região 3’ de uma ADN-metiltransferase, constituindo assim locais onde a elevada homologia com os genes, facilitam a recombinação e a integração do gene no locus vazio. Um estudo recente sugere que estes fenómenos de perda e ganho de hopM e hopN estão associados a um mecanismo complexo de recombinação, no qual ocorre uma duplicação seguida de inversão de uma extensa região cromossómica [118,124].
A análise das sequências dos genes hopM e hopN mostrou, na maioria das estirpes estudadas, a presença de uma ORF completa, havendo no entanto cerca de 2,6% das estirpes com sequências truncadas. Em todas estas estirpes o desfasamento da grelha de leitura deveu-se ao desemparelhamento entre as bases complementares (misparing), resultando na adição ou delecção de unidades CT na região 5’ de ambos os genes. Esta alteração do número de repetições pode originar a adição ou remoção de codões STOP, alterando a expressão da proteína devido à mudança de fase on/off [60]. Assim, em ambos os genes pode ocorrer variação de fase e regulação da expressão génica pelo mecanismo de slipped-strand misparing, à semelhança do que já foi descrito para outros genes de OMPs, tais como babB, sabA e sabB, hopZ, oipA e homB [64,104,105,108,125]. A variação de fase como mecanismo de diversidade é utilizada por várias espécies bacterianas e tem sido sugerido como marcador consistente de genes envolvidos da adaptação a um nicho específico ou na evasão à resposta imunitária, contribuindo para a variação antigénica e/ou virulência durante a infecção [60,127,128]. Um exemplo deste mecanismo foi demonstrado para os genes babA e babB, no qual a mudança de fase de leitura possibilita à bactéria a constituição de uma população heterogénea, com dinâmicas de adesão diferentes permitindo-lhe adaptar-se a diferentes condições ambientais [99]. Assim, tendo em conta a possibilidade de ambos os genes hopM e hopN serem regulados por variação de fase e por eventos de recombinação intra e intergenómica, podemos mais uma vez especular que estes genes estão envolvidos na adaptação de H. pylori ao seu hospedeiro humano.
Um estudo de complexos de proteínas de H. pylori mostrou que BabA e BabB formam complexos com HopM e HopN [109]. Por outro lado, estudos recentes sugerem que nenhuma das proteínas BabA ou BabB é capaz de induzir resposta imunitária em macacos [109,111], nem são os antigénios imunodominantes em humanos [109,112]. Uma hipótese que poderia explicar este facto seria a de que as proteínas de membrana que interagem com BabA ou BabB, por exemplo, HopM e HopN, poderiam mascarar os epítopos daquelas proteínas e consequentemente serem elas próprias expostas e assim antigénicas [109]. Esta hipótese é ainda corroborada pelo facto de as proteínas HopN e HopM terem demonstrado reactividade contra soros de pacientes positivos para H. pylori [109,113].
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Todos estes dados sugerem que as proteínas HopM e HopN poderão desempenhar um papel importante na relação entre a bactéria e o seu hospedeiro, nomeadamente, constituindo prováveis antigénios e consequentemente importantes alvos vacinais [109,110],
ou por outro lado, poderão desempenhar um papel na adesão de H. pylori à célula epitelial gástrica, visto que formam complexos com uma das principais adesinas, BabA [109,110].
Com o objectivo de tentar clarificar o papel destes genes na virulência das estirpes de
H.pylori, foram avaliadas as associações entre a presença dos genes hopM/hopN e a
patologia e o perfil de virulência da estirpe. No geral, foi verificada uma associação estatisticamente significativa entre a cópia única hopN e o genótipo mais virulento (cagA e
vacAs1 positivas), e entre a dupla cópia hopM e a dupla cópia MN e o genótipo menos
virulento (cagA negativo, vacAs2). Verificou-se ainda, na população de origem ocidental, a associação estatisticamente significativa entre a dupla cópia hopN e o genótipo mais virulento e da dupla cópia hopM e o perfil menos virulento. Mais uma vez, estes dados sugerem um papel determinante destes genes na relação entre a bactéria e o seu hospedeiro. A clarificação das suas funções é por isso crucial e será posteriormente avaliada através de estudos funcionais das respectivas proteínas, nomeadamente a avaliação das propriedades antigénicas e da contribuição de HopM e HopN para as características pró-inflamatórias de H. pylori, bem como o esclarecimento do envolvimento destas proteínas na adesão à mucosa gástrica.
A reconstrução filogenética dos genes hopM e hopN sugere uma segregação baseada na origem geográfica da estirpe, com as estirpes de origem ocidental e asiática a apresentarem uma maior divergência entre si. Esta divergência foi também observada noutros genes de H.
pylori, tais como, genes que codificam outras OMPs (homA/homB e babA/babB), genes de
virulência (cagA e vacA) e genes housekeeping[38,63,107,129].
Os dois genes revelaram um elevado grau de similaridade entre si, com uma distância moleular de 0,146±0,006 ao nível da sequência de ADN e de 0,161±0,011 na sequência de aminoácidos. Estes resultados são bastante similares aos observados para outros genes duplicados de OMPs [54,97] o que sugere a existência de fenómenos de duplicação ou conversão génica e de recombinação intra e intergenómica entre eles.
Globalmente, os genes hopM e hopN apresentaram taxas de substituição de nucleótidos muito semelhantes, com predomínio das substituições sinónimas, sugerindo que os dois genes estão sujeitos aos mesmos constrangimentos funcionais, sendo estes mantidos por acção da selecção negativa ou purificadora.
De uma maneira geral, dentro de cada gene, observa-se uma maior conservação do segmento 2 (Figura 5 e 6 e Tabela 2), enquanto o segmento 4 apresenta maior distância molecular, quer ao nível da sequência de nucleótidos quer ao nível da sequência de aminoácidos. Mais concretamente, o segmento 4 de ambos os genes revelou um elevado
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polimorfismo, apresentando diferenças acentuadas, tanto entre genes (Figura 5) como dentro de cada gene (Figura 6). Este polimorfismo foi consistente com a elevada taxa de substituição de nucleótidos observada neste segmento (Tabela 2) e com a maior distância molecular das sequências deste segmento quando comparado com os outros três, permitindo identificá-lo como região alélica. Assim, no segmento 4, foi possível identificar quatro variantes alélicas, comuns aos dois genes, à semelhança do que foi previamente descrito num trabalho utilizando apenas estirpes de referência [118]. A existência de variação alélica entre genes que codificam OMPs, é um mecanismo de diversidade amplamente identificado, tendo sido já várias vezes descrito em H.pylori
[63,64,105,109,110]. Para hopM e hopN, observaram-se duas variantes alélicas globalmente mais prevalentes (alelos AI e AII) e toda a análise realizada ao nível das sequências sugere que as outras duas variantes (alelos AIII e AIV), menos prevalentes a nível mundial, resultaram de fenómenos de recombinação intra ou intergenómicas, entre as variantes mais frequentes.
No global, nenhum alelo foi significativamente associado com a patologia ou a origem geográfica da estirpe, provavelmente devido à maior frequência dos tipos AI e AII, tanto nas diferentes patologias estudadas como nas diferentes origens geográficas. No entanto, são de sublinhar duas diferenças marcadas, o facto de o alelo AII ser o mais prevalente nas estirpes asiáticas e não o AI como nas estirpes ocidentais e africanas, e o alelo AIV não ter sido detectado em nenhuma estirpe asiática.
A distribuição das variantes alélicas pelo genótipo de virulência, na totalidade da população em estudo, não mostrou nenhuma associação. No entanto, considerando cada grupo geográfico individualmente, verificou-se na população ocidental a associação estatisticamente significativa entre o alelo AII e o genótipo menos virulento e do alelo AIII com o genótipo mais virulento, para os dois genes em conjunto e também para estes alelos do gene hopN. Estas diferenças verificadas em populações de origem geográfica diferente podem reflectir a adaptação da bactéria a pressões selectivas distintas, encontradas em hospedeiros específicos, afectando a sua virulência [63,64]. Assim, a variação alélica observada nos genes hopM e hopN, para além de contribuir para a variação antigénica, pode ter um papel importante na virulência da estirpe, numa determinada população humana, reflectindo o complexo processo evolutivo que ocorre durante uma infecção persistente, resultado das pressões antigénicas ou variações funcionais a que esteve sujeita, para persistir numa população hospedeira específica.
Em suma, os resultados obtidos no presente trabalho, sugerem que os genes hopM e
hopN contribuem para a adaptação e logo para a persistência da infecção por H. pylori.
Mais, as variantes alélicas podem constituir biomarcadores da virulência da estirpe em determinadas populações.
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