Les facteurs pro-apoptotiques de la famille RHG

Un crible génétique, réalisé en 1994 par l’équipe d’Hermann Steller, a révélé que les embryons homozygotes mutants pour la délétion H99 ne présentent pas de mort cellulaire développementale et sont résistants à l’apoptose induite par irradiation (White et al., 1994). Cette délétion élimine 300kb d’ADN génomique dans la région 75C1 du chromosome 3. Des études ont permis de mettre en évidence que cette région contient trois gènes, reaper (rpr), hid (head involution defective) et grim et qu’ils sont tous les trois requis pour l’apoptose (Chen et al., 1996b; Grether et al., 1995; White et al., 1996). Ces gènes sont communément appelés

3

2

1

a.  

b.  

Figure   n°10   :   Les   mo:fs   IBM   des   protéines   RHG   présentent   de   fortes   similarités   mais   ne   sont   pas   interchangeables.    

(a)  Alignement  du  domaine  conservé  N-­‐terminal  de  Rpr,  Grim,  Hid  et  Sickle.  Ce  domaine  de  14  acides  

aminés,  présent  dans  les  4  protéines,  est  responsable  de  l’interacDon  avec  le  domaine  BIR  des  IAPs.   On  parle  de  moDf  IBM  ou  RHG.    

             Issu  de  Claveria  and  Torres,  2003    

(b)  Un  marquage  anD-­‐β  Galactosidase  permet  de  visualiser  les  cellules  gliales  de  la  ligne  médiane  du  

système   nerveux   central   embryonnaire   en   ventral   ainsi   qu’un   sous-­‐type   de   neurones.   Suite   à  

l’expression  de  grim  (2)  on  observe  une  nebe  diminuDon  du  nombre  de  cellules  gliales  par  rapport  à  

un  embryon  sauvage  (1).  Cebe  observaDon  est  cohérente  avec  la  foncDon  pro-­‐apoptoDque  de  Grim.  

Par  contre,  suite  à  l’expression  de  R/grim  (3)  (forme  chimérique  dans  laquelle  le  moDf  RHG  de  Grim  

a  été  remplacé  par  celui  de  Rpr),  on  n’observe  pas  de  variaDon  du  nombre  de  cellules  gliales  par   rapport  à  un  embryon  contrôle  (1).  Le  remplacement  du  moDf  RHG  de  Grim  par  celui  de  Rpr  élimine   la  capacité  de  Grim  d’induire  la  mort  cellulaire  dans  la  ligne  médiane  du  système  nerveux  central   embryonnaire.      

             Issu  de  Wing  et  al.,  1998  et  Wing  et  al.,  2001    

Figure   n°9   :   Représenta:on   schéma:que   de   la   structure   des   membres   de   la   famille   RHG   chez   la   drosophile  

Toutes   les   protéines   RHG   possèdent   un   moDf   RHG   également   appelé   IBM.   Pour   être   foncDonnel,   ce   moDf  doit  être  localisé  en  N-­‐terminal  de  la  protéine.  Cela  survient  après  éliminaDon  de  la  méthionine   iniDatrice   pour   Rpr,   Grim,   Hid   et   Sickle.   dOmi/HtrA2   et   Jafrac2   exposent   le   moDf   RHG/IBM   à   leur   extrémité   N-­‐terminale   après   un   clivage   post-­‐traducDonnel   qui   élimine   une   séquence   d’adressage,   respecDvement  à  la  mitochondrie  et  au  réDculum  endoplasmique.    

Adapté  de  Xu  et  al.,  2009  et  Bergmann,  2010.    

Rpr   Grim   Hid   Sickle   dOmi/HtrA2   Jafrac2   RHG   RHG   RHG   RHG   RHG   RHG  

26 RHG pour Rpr, Hid et Grim. La surexpression de n’importe lequel de ces trois gènes est suffisante pour induire une mort cellulaire dépendante des caspases. Chez la drosophile, trois gènes supplémentaires appartenant à cette famille ont été identifiés : jafrac2 (Tenev et al., 2002), sickle (skl) (Christich et al., 2002; Srinivasula et al., 2002; Wing et al., 2002a) et dOmi/HtrA2 (drosophila Omi/high temperature requirement A2) (Challa et al., 2007; Igaki et al., 2007; Khan et al., 2008). Ces trois gènes étant moins bien caractérisés génétiquement et biochimiquement que rpr, hid, et grim, leur mode d’action ne sera pas détaillé ici (pour dOmi/HtrA2 voir paragraphe I.B.4.d).

Les protéines RHG présentent peu de similarité mais elles possèdent un motif conservé en N-terminal appelé motif RHG ou IBM (IAP binding motif) (Figures 9 et 10). Ce motif est nécessaire pour que les protéines RHG assurent pleinement leurs fonctions pro-apoptotiques (Vucic et al., 1998; Vucic et al., 1997b; Wing et al., 1998) (Haining et al., 1999; McCarthy and Dixit, 1998; Wing et al., 2001). De façon intéressante, ces motifs ne sont pas interchangeables (Figure 10). En effet, contrairement à l’expression de grim, l’expression d’une forme chimérique R/grim (dans laquelle le motif RHG de Grim a été remplacé par celui de Rpr) ne permet pas d’induire la mort des cellules de la ligne médiane du système nerveux central embryonnaire (Wing et al., 2001). Les motifs RHG de Grim et de Rpr sont donc fonctionnellement différents. Cette donnée est en accord avec la faible redondance fonctionnelle entre les membres de la famille RHG. Il existe de nombreux cas d’apoptose développementale nécessitant spécifiquement un des gènes de la famille RHG. Par exemple, Hid est essentiel pour la mort des cellules inter-ommatidiales dans l’œil en développement (Yu et al., 2002), alors que Grim est requis, d’une part, pour l’apoptose des cellules gliales dans le lignage des microchaetes (soies mécano-sensorielles présentes sur le thorax de la drosophile) (Wu et al., 2010), et d’autre, pour la mort des précurseurs des neurones sensoriels au niveau de la marge postérieure de l’aile (Rovani et al., 2012). En outre, Rpr et Hid sont spécifiquement requis pour la mort de différents sous-types neuronaux au sein de la médulla pendant la neurogenèse du cerveau larvaire (Bertet et al., 2014). Toutefois, une coopération entre les différents membres de la famille RHG est nécessaire pour induire efficacement la mort de certains types cellulaires (Draizen et al., 1999; Jiang et al., 2000; Lee et al., 2013; Robinow et al., 1997; Tan et al., 2011; Wing et al., 1998; Zhou et al., 1997).

Le profil d’expression des gènes RHG reflète assez bien le profil de mort cellulaire, notamment au stade embryonnaire. En effet, grim et rpr sont transcrits uniquement dans les cellules destinées à mourir (Chen et al., 1996b; Robinow et al., 1997; White et al., 1994). hid fait exception en étant exprimé à la fois dans les cellules destinées à mourir et dans les cellules qui survivent (Bangs et al., 2000). Ce profil dynamique d’expression des RHG reflète une régulation complexe de ces gènes (principalement transcriptionnelle). En effet, les promoteurs de rpr, hid, et grim sont capables de répondre à divers signaux développementaux et environnementaux contrôlant l’apoptose (Jiang et al., 1997; Kang et al., 2014; Kurada and White, 1998; Nordstrom et al., 1996; Robinow et al., 1997). Ces gènes partagent des régions régulatrices contenant de nombreux éléments « enhancer » ou « silencer » qui sont la cible de divers facteurs de transcription (Link et al., 2013; Lohmann, 2003; Tan et al., 2011; Zhang et al., 2008). Par exemple, en réponse à l’irradiation, le facteur de transcription Dmp53

RING  

BIR1   BIR2   ^Ubc

D 1   Morgue   Hid   Gri m ,  Rp r   Ub   Ub   Ub   ?   Poly-­‐ubiqui:na:on  K48   Ub   Ub   Ub   Ub   Ub   Ub   Dégrada:on   par  le   protéasome  

Figure  n°12  :  Ubiqui:na:on  de  Diap1  et  des  RHG  

Rpr,  Hid  et  Grim  favorisent  la  poly-­‐ubiquiDnaDon  de  Diap1  et  sa  dégradaDon  de  façon  dépendante  de   UbcD1.  Morgue  interagit  avec  Diap1  et  pourrait  coopérer  avec  UbcD1  pour  induire  la  dégradaDon  de   Diap1.   A   l’inverse,   les   protéines   Rpr,   Hid   et   Grim   sont   poly-­‐ubiquiDnées   par   Diap1,   elles   sont   par   conséquent  adressées  au  protéasome  pour  être  dégradées.    

Adapté  de  Vaux  and  Silke,  2005  

Figure  n°11  :  Résumé  des  différents  mécanismes  de  régula:on  du  facteur  pro-­‐apopto:que  Hid  

Hid  est  capable  d’inhiber  les  IAPs  et  ainsi  induit  une  apoptose  dépendante  des  caspases.  La  transcripDon  

du  gène  hid  est  contrôlée  par  de  nombreux  facteurs  de  transcripDon  (comme  p53  ou  E2F)  et  diverses  

voies  de  signalisaDon  telle  que  la  voie  JNK.  Le  niveau  de  Hid  est  de  plus  contrôlé  par  des  microARNs.   Enfin,  la  voie  MAPK  inhibe  l’acDvité  de  Hid  par  phosphorylaDon.  Les  régulaDons  posiDves  sont  indiquées   en  bleu  alors  que  celles  ayant  un  effet  négaDf  sur  Hid  sont  en  rouge.      

27 active l’expression de rpr, skl et hidvia l’enhancer IRER (Irradiation-Responsive Enhancer Region) situé en amont de rpr (Brodsky et al., 2000).Pour illustrer cette régulation transcriptionnelle des RHG, on peut également citer le fait qu’en réponse à l’hormone stéroïdienne ecdysone, le complexe récepteur à l’ecdysone/ultraspiracle s’associe à la déméthylase dUTX et lie le promoteur de rpr pour augmenter sa transcription (Denton et al., 2013b). En outre, les protéines Hox, Deformed et Abdominal B, régulent la transcription de rpr au cours du développement (Alonso, 2002; Lohmann et al., 2002). L’expression de hid est elle directement régulée par le facteur de transfection dE2F1 ce qui module la sensibilité à l’apoptose induite par dommages à l’ADN (Moon et al., 2005). Au-delà de ces régulations transcriptionnelles, la voie EGFR/Ras/MAPK induit la phosphorylation de la protéine Hid à l’origine de son inactivation (Bergmann et al., 1998). Cette régulation survient notamment dans l’embryon au sein d’un sous-groupe de cellules gliales de la ligne médiane pour assurer leur survie (Bergmann et al., 2002). Le niveau de Hid est donc contrôlé à de multiples niveaux (Bilak and Su, 2009) (Figure 11). L’ensemble de ces régulations des différents membres de la famille RHG permet une régulation fine de la mort cellulaire en réponse à une grande variété de signaux et évite qu’une cellule ne soit tuée de façon accidentelle par l’activation inappropriée d’un facteur pro-apoptotique de la famille RHG. Ces protéines RHG sont capables de réguler l’activité des caspases à plusieurs niveaux.

Tout d’abord, par l’intermédiaire de leur motif IBM N-terminal, les protéines RHG sont capables de lier les domaines BIR de Diap1 (Chai et al., 2003; Christich et al., 2002; Srinivasula et al., 2002; Tenev et al., 2002; Vucic et al., 1997a; Vucic et al., 1998; Wu et al., 2001; Yan et al., 2004) et donc par compétition de perturber l’interaction entre Diap1 et les caspases. Rpr et Grim lient avec la même affinité les domaines BIR1 et BIR2 de Diap1 alors que Hid, Skl et Jafrac2 lient préférentiellement le domaine BIR2 (Zachariou et al., 2003). Par conséquent, Rpr et Grim sont capables de lever l’inhibition sur les caspases effectrices et l’ensemble des RHG s’opposent à l’inhibition de Dronc par Diap1.

Toutefois, l’activité pro-apoptotique des protéines RHG ne réside pas uniquement dans cette compétition de liaison. En effet, la liaison des RHG à Diap1 d’une part, stimule l’auto-ubiquitination de Diap1 en changeant la spécificité de substrat du domaine RING de Diap1 et, d’autre part, favorise son ubiquitination par d’autres enzymes E3 ubiquitine ligases (Figure 12) (Hays et al., 2002; Holley et al., 2002; Ryoo et al., 2002; Wing et al., 2002b; Yoo, 2005; Yoo et al., 2002). Ainsi, Rpr, Hid et Grim réduisent le niveau protéique de Diap1 en favorisant sa dégradation par le protéasome. Les enzymes E2 de conjugaison de l’ubiquitine impliquées dans l’ubiquitination de Diap1 ont été identifiées : Morgue (Modifier of reaper and grim ubiquitously expressed) et UbcD1 (Hays et al., 2002; Ryoo et al., 2002; Wing et al., 2002b; Yoo, 2005). La perte de fonction de l’un ou l’autre de ces gènes réduit la mort cellulaire induite par l’expression ectopique des RHG. ubcD1 code pour une E2 classique alors que morgue code pour un variant d’enzyme de conjugaison de l’ubiquitine dépourvu du résidu cystéine catalytique (Vaux and Silke, 2005). Toutefois Morgue possède un domaine à boite F caractéristique des E3 ligases. UbcD1 et Morgue pourraient donc agir de concert pour ubiquitiner Diap1, mais le mécanisme précis d’ubiquitination reste à déterminer (Zhou et al 2013).

Protéasome  26S  

Condi&ons  de  survie  

X  

Condi&ons  de  mort  

Figure  n°13  :  Régula&on  de  Grim  par  Diap1  et  par  les  caspases  

Grim  interagit  avec  Diap1  par  l’intermédiaire  de  ses  domaines  BIR1  et  BIR2.  Grim  liée  au  domaine  BIR2   est  ubiquiBnée  sur  la  lysine  136  (K136).  Dans  des  condiBons  de  survie,  le  niveau  de  Grim  dans  la  cellule   est   bas.   Par   conséquent   la   plupart   des   protéines   Grim   sont   ubiquiBnées   et   dégradées   par   le   protéasome.  Toutefois,  dans  des  condiBons  de  mort,  le  niveau  de  protéine  Grim  est  élevé,  la  caspase   effectrice   Drice   est   acBvée   et   peut   cliver   Grim   au   niveau   de   l’Asparagine   132   (D132).   La   porBon   C-­‐ terminale   de   Grim   comportant   les   chaines   d’ubiquiBnes   liées   à   la   lysine   136   est   éliminée.   Grim   peut   s’accumuler  et  amplifier  l’acBvaBon  des  caspases.      

Adapté  de  Yeh  and  BraTon,  2014  

Mitochondrie   Monomère   APAF-­‐1   Forma&on  de     l’apoptosome   Pro-­‐caspase  9   Cytochrome  c  

Smac  et  Omi  

XIAP  

Recrutement  et  ac&va&on   de  la  caspase  9   APOPTOSE   Mort  cellulaire   indépendante  des   caspases   Ac&va&on  des   caspases  3/7  

Perte  de  la  fonc&on  mitochondriale    

Libéra&on  de  protéines   mitochondriales  toxiques   Perméabilisa&on  de  la  

membrane  externe   mitochondriale  induite  par  

Bax/Bak  

Figure  n°14  :  Régula&on  mitochondriale  de  la  mort  cellulaire  chez  les  mammifères  

La  perméabilisaBon  de  la  membrane  externe  mitochondriale  induite  par  Bax/Bak  peut  conduire  à  une   apoptose  dépendante  des  caspases  (à  gauche)  ou  à  une  mort  cellulaire  indépendante  des  caspases  (à   droite).   Après   ceTe   perméabilisaBon,   des   protéines   solubles   sont   libérées   depuis   l’espace   intermembranaire   mitochondrial   dans   le   cytoplasme.   Le   cytochrome   c   lie   APAF-­‐1   ce   qui   induit   son   oligomérisaBon   et   le   recrutement   de   la   pro-­‐caspase   9   au   sein   de   l’apoptosome.   Cela   conduit   à   l’acBvaBon  de  la  caspase  9  qui  va  ensuite  acBver,  par  clivage,  les  caspases  3  et  7.  Smac  et  Omi  facilitent   l’acBvaBon   des   caspases   en   neutralisant   XIAP.   La   perméabilisaBon   de   la   membrane   externe   mitochondriale   permet   également   une   mort   cellulaire   indépendante   des   caspases   par   le   biais   d’une   perte  graduelle  de  la  foncBon  mitochondriale  et  par  la  libéraBon  de  protéines  toxiques.    

28 De façon intéressante, les protéines RHG, qui induisent l’ubiquitination de Diap1, sont elles-mêmes ubiquitinées par Diap1 et adressées au protéasome (Figure 12) (Olson et al., 2003b; Yeh and Bratton, 2013). ReaperKR, une forme mutante de Reaper dans laquelle toutes les lysines (résidus accepteurs d’ubiquitine) ont été substituées par des arginines, est un meilleur inducteur de mort que la forme sauvage de Reaper. L’ubiquitination de Rpr par Diap1 restreint donc son activité pro-apoptotique. Par conséquent, Diap1 et les protéines RHG contrôlent mutuellement leur abondance. Le « gagnant » de cette bataille Diap1 versus RHG va déterminer le devenir de la cellule. Toutefois, on ne connait pas encore aujourd’hui précisément les éléments qui vont faire pencher la balance en faveur de la mort cellulaire. La présence de l’enzyme E2 atypique Morgue pourrait favoriser la dégradation de Diap1 et donc l’apoptose. Par ailleurs, il a été récemment mis en évidence que la caspase effectrice Drice, sous sa forme active, clive Grim en C-terminal au niveau de l’Asparagine 132. Ce clivage empêche et/ou élimine l’ubiquitination de Grim en éliminant le seul résidu lysine présent dans la séquence de Grim. Sous sa forme clivée, Grim reste lier à Diap1 et favorise ainsi un niveau élevé d’activation des caspases (Figure 13) (Yeh and Bratton, 2013; Yeh and Bratton, 2014). Par conséquent, un faible niveau de caspases actives suffit à déséquilibrer la balance en faveur des RHG et déclenche ainsi la mort cellulaire.

Par ailleurs, Rpr et Grim ont la capacité d’inhiber la traduction générale dans la cellule (Holley et al., 2002; Tait et al., 2004; Yoo et al., 2002). Diap1 ayant une courte durée de vie, cette inhibition de la traduction conduit à une rapide déplétion de Diap1 et donc à une activation des caspases. Le mécanisme d’action de Rpr a été précisé : Rpr lie la petite sous-unité ribosomale (40S) et inhibe l’étape d’initiation de la traduction en altérant la reconnaissance du codon d’initiation (Colon-Ramos et al., 2006; Pestova and Hellen, 2006). Les transcrits de rpr, hid, et grim possèdent dans leur région 5’UTR une séquence IRES (Internal Ribosome Entry Site) (Hernandez et al., 2004; Vazquez-Pianzola et al., 2007). Par conséquent, ils peuvent être traduits par un mécanisme alternatif en dépit de l’inhibition exercée par la protéine Rpr sur la petite sous-unité ribosomique.

Ainsi les membres de la famille RHG induisent l’apoptose d’une part en libérant les caspases de Diap1 par compétition de liaison, et d’autre part, en favorisant la déplétion de Diap1 via une stimulation de sa dégradation ou une inhibition de sa synthèse de novo. L’activité pro-apoptotique de ces protéines réside également dans leur capacité à induire une voie de mort mitochondriale. Cette fonction des RHG sera détaillée dans le paragraphe I.B.4.c.

Chez les mammifères, la protéine Smac/Diablo contient un motif IBM et fonctionne de façon similaire aux protéines RHG. En effet, Smac/Diablo interagit avec de nombreuses protéines de la famille des IAPs et lève ainsi l’effet inhibiteur que les IAPs exercent sur les caspases (Figure 14) (Chai et al., 2000; Srinivasula et al., 2000). Smac/Diablo représente donc l’homologue fonctionnel des protéines RHG de drosophile. Ceci illustre bien la conservation de la machinerie de mort cellulaire au cours de l’évolution. Toutefois, le mode d’activation de Smac/Diablo diffère de celui des RHG : Smac/Diablo est une protéine mitochondriale qui suite à un stimulus apoptotique est libérée dans le cytosol où elle va assurer sa fonction pro-apoptotique. Cette donnée laisse

a)  Transfert  de  lipides   ^{b)  Perméabilisa&on  de  la  membrane}  _{externe  mitochondriale}  

c)  Perte  de  fonc&on  mitochondriale  

Gonflement   d)  Fragmenta&on  

e)  Remodelage  des  crêtes  

Altéra&ons   mitochondriales   pendant   l’apoptose   RE   Bax  ac&f   Drp1   Mfn2   Cyt  c   Complexe  OPA1  

Désassemblage  du  complexe  OPA1   Cardiolipin  

Phospha&dylethanolamine   Lipides  provenant  du  RE  

tBid   Bcl-­‐XL  

Facteurs  apopto&ques   Bax  inac&f  

Bax/Bak  ac&f  

Figure  n°15  :  Altéra&ons  mitochondriales  au  cours  de  l’apoptose  chez  les  mammifères  

Au  cours  de  l’apoptose,  plusieurs  altéraBons  mitochondriales  peuvent  être  observées  :    

(a)  Un  transfert  de  lipides  entre  les  membranes  mitochondriales  ou  entre  la  membrane  du  réBculum   endoplasmique  et  les  membranes  mitochondriales  

(b)  Une  perméabilisaBon  de  la  membrane  externe  mitochondriale  

(c)  Une  perte  de  la  foncBon  mitochondriale  :  du  fait  de  la  perméabilisaBon,  la  membrane  gonfle  et  le   potenBel  de  la  membrane  interne  chute  (_ΔΨm)  

(d)  Une  fragmentaBon  du  réseau  mitochondrial   (e)  Un  remodelage  des  crêtes  mitochondriales   Adapté  de  CosenBno  and  García-­‐Sáez,  2014  

29 entrevoir un rôle de la mitochondrie dans la mort cellulaire chez les mammifères. Nous verrons dans la suite de cette introduction que ce rôle n’est pas aussi évident chez la drosophile.