Figure n°22 : Le mo(f GH3, conservé entre Rpr, Grim et Sickle, est nécessaire et suffisant pour assurer une localisa(on mitochondriale.
(a) Alignement du domaine conservé GH3 de Rpr, Grim et Sickle. Les résidus iden?ques et similaires sont respec?vement indiqués dans des carrés noirs et gris.
Issu de Claveria and Torres, 2003
(b-‐d) Les différentes protéines étudiées sont détectées en vert et on visualise en rouge un marqueur mitochondrial. Grim-‐GFP et Rpr-‐GFP se localisent à la mitochondrie dans des cellules de drosophile (b). Les protéines GrimΔGH3-‐GFP et RprΔGH3-‐GFP sont cytoplasmiques (c). Le domaine GH3 est donc nécessaire à la localisa?on mitochondriale de Grim et Rpr. Contrairement à la GFP qui est cytoplasmique, GH3Grim-‐GFP et GH3Rpr-‐GFP ont une localisa?on mitochondriale (d). Le domaine GH3 est donc suffisant pour assurer une localisa?on mitochondriale.
Adapté de Claveria et al., 2002 et Olson et al., 2003a
a.
b.
c.
34 Grim et il est suffisant in vitro pour induire de la mort cellulaire (Chen et al., 2004; Claveria et al., 2002; Claveria et al., 2004; Freel et al., 2008; Olson et al., 2003a; Wing et al., 1998).
De façon intéressante, Rpr et Grim se localisent à la mitochondrie et cette localisation est dépendante du domaine GH3 (Figure 21 et 22) (Claveria et al., 1998; Claveria et al., 2002; Claveria et al., 2004; Freel et al., 2008; Olson et al., 2003a; Sandu et al., 2010; Thomenius et al., 2011). Ce domaine ne correspond pourtant pas, en tant que tel, à une séquence d’adressage mitochondriale. Freel et al. ont montré que le domaine GH3 permet à Rpr de s’enchâsser dans la membrane externe mitochondriale via une interaction de ce domaine avec les lipides membranaires (Figure 21) (Freel et al., 2008). Sandu et al. envisagent un autre modèle pour expliquer la localisation mitochondriale de Rpr. Comme Rpr et Grim, Hid est retrouvé localisé au niveau de la mitochondrie (Haining et al., 1999; Sandu et al., 2010). Mais contrairement aux deux autres, Hid possède une séquence d’insertion dans la membrane mitochondriale en C-terminal (Figure 20). La présence de cette séquence et la protéine Cdk7 (Cyclin-dependent kinase 7) sont requises pour la localisation mitochondriale de Hid (Figure 21) (Haining et al., 1999; Morishita et al., 2013; Sandu et al., 2010). Sandu et al. ont mis en évidence une interaction physique entre Hid et Rpr par le biais de la région hélicale centrale de Rpr qui comprend le domaine GH3. Cette interaction est requise pour la localisation mitochondriale de Rpr (Sandu et al., 2010). Rpr serait donc recruté à la mitochondrie par l’intermédiaire de son domaine GH3 en interagissant avec Hid qui lui possède une séquence d’insertion dans les membranes mitochondriales (Figure 21).
Plusieurs études indiquent que la localisation mitochondriale des RHG est importante pour leur fonction pro-apoptotique. RprGH3, une forme de Rpr dépourvue du domaine GH3 qui n’est donc pas mitochondriale, a une capacité réduite à induire de la mort cellulaire (Olson et al., 2003a). De façon intéressante, RprGH3 est incapable de stimuler l’ubiquitination et la dégradation de Diap1 bien qu’elle conserve la capacité de lier les IAPs (Olson et al., 2003a). Toutefois, l’ajout de la séquence d’adressage mitochondriale de Hid à RprGH3 est suffisant pour restaurer la dégradation de Diap1 et l’induction efficace de mort cellulaire (Olson et al., 2003a). Par ailleurs, RprGH3 peut induire la dégradation de Diap1, si Diap1 est adressé artificiellement à la mitochondrie (Freel et al., 2008). Ces données indiquent que la dégradation de Diap1 induite par Rpr requière une localisation mitochondriale de Rpr. En outre, la protéine Hid, qui est impliquée dans la localisation mitochondriale de Rpr, est requise pour que Rpr stimule efficacement l’ubiquitination de Diap1 (Sandu et al., 2010). L’équipe d’Hermann Steller envisage que le principal rôle de Hid serait d’assembler un complexe macro-moléculaire au niveau de la mitochondrie afin de recruter Rpr (Figure 21) (Sandu et al., 2010). Au sein de ce complexe, Rpr induirait l’ubiquitination de Diap1 et serait plus actif à la mitochondrie, du fait de la concentration locale de différents régulateurs de l’apoptose. Il a notamment été montré que Dronc et Drice se localisent à la mitochondrie (Dorstyn et al., 2002). Rpr pourrait donc faire partie d’un grand complexe localisé à la mitochondrie qui régulerait la stabilité de Diap1 et l’activation des caspases.
Cette dépendance entre inhibition de Diap1 et localisation mitochondriale n’est pas vraie dans le cas de Grim. En effet, des données indiquent que les domaines RHG et GH3 de Grim activent des voies de mort
35 différentes, respectivement une inhibition de Diap1 et une voie de mort mitochondriale (Claveria et al., 2002). Ces deux voies peuvent coopérer in vivo pour induire efficacement la mort cellulaire (Claveria et al., 2002). La voie de mort mitochondriale induite par le domaine GH3 de Grim n’est pas bien caractérisée. Il a été montré que Grim peut interagir physiquement avec Buffy et Debcl (Wu 2010), mais les conséquences de cette interaction restent à déterminer.
Au-delà de cette localisation mitochondriale de Rpr, Hid et Grim, d’autres données soutiennent l’existence d’une voie de mort mitochondriale en aval de ces protéines pro-apoptotiques. En effet, Rpr, Grim et Hid induisent une perméabilisation de la mitochondrie associée à une libération du cytochrome c dans des cellules de drosophile ou dans d’autres systèmes modèles (Abdelwahid et al., 2007; Claveria et al., 1998; Claveria et al., 2004; Evans et al., 1997; Goyal et al., 2007; Thress et al., 1999; Thress et al., 1998). De plus, une perméabilisation mitochondriale dépendante des RHG est observée au cours de l’apoptose induite par des dommages à l’ADN dans des embryons de drosophile (Abdelwahid et al., 2007). Par ailleurs, la surexpression de rpr conduit à des défauts mitochondriaux, comme une chute du potentiel de membrane mitochondriale (Brun et al., 2002).
Ces données suggèrent une homologie fonctionnelle entre les RHG de drosophile et les membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 de mammifères. Il est intéressant de noter que les domaine GH3 (des RHG) et BH3 (des protéines de la famille Bcl-2) ont une structure similaire (hélice alpha amphiphatique) (Claveria et al., 2002). Par ailleurs, cette homologie fonctionnelle est soutenue par le fait que le remplacement du domaine BH3 de Bad par le domaine GH3 de Grim n’altère ni la localisation mitochondriale ni la capacité de Bad d’induire la libération de cytochrome c et la mort cellulaire (Claveria et al., 2004). En outre, comme décrit précédemment Grim peut s’associer à Debcl et Buffy (Wu et al., 2010). Par conséquent Debcl, Buffy et les RHG pourraient conjointement contrôler une voie de mort mitochondriale et ainsi ces protéines assureraient ensemble une fonction comparable à celle tenue par les membres de la famille Bcl-2 chez les mammifères.
d) Il existe d’autres protéines mitochondriales impliquées dans l’apoptose
Au-delà des RHG et des membres de la famille Bcl-2, d’autres protéines mitochondriales semblent jouer un rôle dans le processus apoptotique chez la drosophile.
Chez les mammifères, Omi/HtrA2 est séquestré dans l’espace membranaire mitochondriale. Au cours de l’apoptose, la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale permet sa libération dans le cytosol où il peut exercer son activité apoptotique en liant et en clivant les IAPs. Un homologue de cette protéine a été identifié chez la drosophile : dOmi/HtrA2 (Challa et al., 2007; Igaki et al., 2007; Khan et al., 2008). Dans les cellules vivantes, dOmi/HtrA2 est localisé dans l’espace inter-membranaire mitochondrial. Après un stimulus apoptotique, il est libéré dans le cytosol mais reste à proximité de la mitochondrie (Challa et al., 2007; Igaki et al., 2007; Khan et al., 2008). La surexpression de domi/htra2 induit de la mort cellulaire in vitro et in vivo (Challa