Les expressions géniques relatives

La technique employée dans le cadre de nos travaux est aussi l’une des plus utilisée : la Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) en temps réel. L’emploi de cette technique implique au préalable de connaître les séquences nucléotidiques des gènes codant pour les protéines d’intérêt. De nombreux travaux ont permis de séquencer ce type de gènes chez l’huître creuse au fil du temps. Il est cependant intéressant de noter que le génome entier de C. gigas a finalement été séquencé (Zhang et al., 2012), ce qui élargit largement le spectre d’étude chez ce modèle au niveau moléculaire.

2.3.1. Principe de la qPCR en temps réel

La PCR est une technique permettant « d’amplifier » (multiplier) une séquence génique ciblée à l’aide d’une enzyme : La Taq (Thermus aquaticus) polymerase. Cette protéine issue d’une bactérie vivant dans des eaux très chaudes présente la propriété de ne pas se dénaturer à haute température, ce qui lui permet de subir les cycles de dénaturations de l’ADN à 95°C sans cesser son activité (Figure 27). Elle n’amplifie cependant que l’ADN, ce qui implique deux étapes préliminaires : (1) l’extraction des ARN messagers (ARNm) totaux de l’échantillon et (2) leur rétro-transcription en ADN complémentaire (ADNc).

Le mélange réactionnel de base de la PCR comprend donc schématiquement : (1) la Taq polymerase, (2) les ADNc de l’échantillon, (3) des bases azotées permettant la synthèse d’ADN par la Taq, (4) un tampon d’activité enrichit en agent intercalant favorisant l’action de la Taq et (5) des amorces spécifiques des gènes d’intérêt.

La réaction de PCR est constituée d’une succession de 40 cycles identiques présentant chacun trois paliers thermiques (Figure 27). Le premier palier à 95°C est la dénaturation : elle permet de s’assurer que tous les ADNc de l’échantillon sont sous forme de simple brin (1b). Le second palier de 30 secondes à 55°C est l’hybridation : elle permet la fixation des amorces sens et anti-sens aux ADNc afin que la Taq polymerase ne synthétise que « le gène » désiré. L’élongation dure finalement 30 secondes à 72°C et correspond à l’étape de synthèse d’ADN par la Taq.

La particularité de la PCR « en temps réel » est la présence dans le mélange réactionnel d’un agent intercalant (SYBR Green I). Cette molécule est un fluorochrome possédant la capacité d’émettre une fluorescence à 530 nm (vert) lorsqu’il est intercalé entre les brins d’ADN suite à l’élongation. L’intensité du signal de fluorescence est donc directement proportionnelle à la quantité d’ADN double brin synthétisé (ou amplicons).

A chaque fin de cycle (dénaturation + hybridation + élongation), le thermocycleur mesure donc la fluorescence de l’échantillon et la reporte sur un graphique. Puisque chaque cycle multiplie par 2 la quantité initiale d’ADN, on peut informatiquement déterminer le « Cycle treshold » (Ct). Ce Ct

94 correspond au nombre de cycles nécessaires pour que la réaction de PCR entre en phase exponentielle (dépassement du « treshold » ou seuil).

De façon logique, le Ct dépend de la quantité d’ADNc introduit dans le mélange réactionnel et donc de la quantité d’ARNm extraits préalablement. Typiquement, plus la quantité extraite d’ARNm du gène ciblé est importante, plus la quantité d’ADNc correspondant sera grande et donc plus le Ct sera faible.

Figure 27 : Principe général de la qPCR SYBR Green

2.3.2. La quantification relative des niveaux d’expression

La méthode de quantification relative de l’ARNm utilisée dans notre étude se base sur les travaux de Livak and Schmittgen (2001) autrement appelée « méthode du ΔCt ». Elle permet d’évaluer l’expression d’un gène en comparant son niveau d’expression à celui d’un gène de référence (« housekeeping gene ») dont l’expression est très stable et ne présente pas de variation en fonction des traitements expérimentaux appliqués.

Les variations d’expression des gènes étudiés ici ont donc été évaluées relativement à l’expression du gène de la β-actine. Ce gène code pour une protéine du cytosquelette exprimée dans la plupart des types cellulaires (Bustin, 2000). Il est l’un des premiers à avoir été utilisé ainsi chez l’huître creuse et l’est toujours aujourd’hui (Park et al., 2009; Zhang et al., 2011). De précédents travaux réalisés sur des stades adultes lors d’études de terrains similaires aux nôtres, ont par ailleurs montré la pertinence de ce choix (Farcy et al., 2007). Dans un souci de représentativité et afin de pouvoir comparer nos travaux sur le terrain à ceux réalisés en laboratoire, la β–actine a donc été employée systématiquement comme gène de référence durant nos travaux.

La méthode de calcul de l’expression génique relative d’un gène ciblé est :

95 Dans le cas d’approches expérimentales nécessitant la comparaison de conditions exposées aux polluants à des conditions contrôle non exposées, un facteur d’induction peut être calculé tel-que :

2.3.3. Réalisation de la qPCR en temps réel

Etape 1 : Extraction des ARN totaux 2.3.3.1.

La première étape consiste à extraire les ARN de la matrice biologique à l’aide d’un kit « Absolutely RNA Miniprep Kit » (Agilent, La Jolla, California). Pour cela, 20 à 40 mg de tissus (branchies ou glande digestive) sont récupérés, décongelés et broyés dans un tampon de lyse à l’aide d’un potter en polypropylène afin de libérer les contenus cellulaires. Ce tampon contient du thiocyanate de guanidine (agent chaotropique) permettant la dénaturation des protéines telles que les RNAse ou les DNAse et favorise la lyse des membranes. Il permet ainsi l’extraction d’acides nucléiques tout en préservant leur intégrité. L’ajout de β-mercaptoéthanol permet de soutenir l’action de dénaturation des RNAse (réduction des ponts disulfures) pour protéger les ARN extraits.

Les broyats sont ensuite préfiltrés sur des micro-colonnes par centrifugation durant 5 minutes à vitesse maximale (13000 g). Après récupération dans des microtubes RNAse free, les contenus cellulaires sont soumis à une étape de déprotéinisation au phénol-chloroforme (phénol:chloroforme:alcool isoamylique - 25:24:1 ; Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri). 600 µL de phénol-chloroforme (vol 1:1) sont ajoutés aux filtrats, puis l’échantillon est homogénéisé au vortex et centrifugé 5 minutes à vitesse maximale. Cette étape correspond à une « extraction liquide-liquide » durant laquelle les composants cellulaires se partitionneront entre : la phase organique phénolée (protéines hydrophobes, lipides etc…) et la phase acqueuse (composés polaires tels que les acides nucléiques).

La phase aqueuse est récupérée à la pipette dans des microtubes et traitée avec un volume équivalent d’éthanol 75% (Ethanol absolu + Eau ultra-pure traitée DEPC). Ce mélange peut ensuite être déposé sur une colonne d’affinité permettant de retenir les acides nucléiques. Après centrifugation 1 minute à 13000 g, les filtrats sont jetés et les colonnes sont soumises à une traitement à la DNAseI : (1) 600 µL d’une solution tampon faiblement concentrée en sels sont déposés sur les micro-colonnes pour réaliser un premier lavage par centrifugation 1 minute à 13000 g ; (2) après séchage des colonnes 1 minute à 13000 g, 55 µL d’une solution de DNAse (5 µL DNAse I reconstituée [1 U/µL] + 50 µL Tampon d’activité) sont déposés sur les colonnes ; (3) les échantillons sont alors incubés 15 minutes à 37°C pour permettre la dégradation de l’ADN ; (4) un lavage avec 600 µL de solution tampon fortement concentrée en sels est réalisé pour éliminer la DNAseI et les fragments d’ADN ; (5) un dernier lavage avec 300 µL de solution tampon faiblement concentrée en sels est appliqué.

Une dernière centrifugation de 2 minutes à 13000 g permet de sécher la colonne contenant les ARN. Elle est alors placée dans un microtube final, et 30 µL de tampon d’élution préalablement chauffé à 60°C sont appliqués. Après 2 minutes d’incubation, une dernière centrifugation 1 minute à 13000 g permet de collecter les ARN purifiés, qui seront stockés à -80°C jusqu’à leur rétrotranscription.

96 Figure 28 : Schéma des étapes successives de l'extraction d'ARN

Etape 2 : Retro-transcription en ADNc 2.3.3.2.

Cette étape permet de transformer les ARNs extraits préalablement en l’ADNc, utilisables lors de la qPCR. Elle est réalisée à l’aide du kit « AffinityScript cDNA synthesis Kit » (Agilent, La Jolla, California) selon les instructions du fournisseur. Dans un premier temps 14 µL d’ARNs (3 à 5 µg) sont mélangés à 1 µL d’oligo-dT (0,5 µg/µL), 1 µL d’hexanucléotides (0,1 µg/µL), 0,8 µL de dNTP (25 mM chacun) et à 2 µL de tampon d’activité 10X. Ce mix est passé 5 minutes à 65°C afin de linéariser les ARNs. En refroidissant, les amorces se fixent à la matrice. Ce n’est qu’après que la transcriptase inverse ou RT pour reverse-transcriptase (1 µL à 1 U/µL) et la RNAse-block (0,5 µL à 40 U/µL) sont ajoutées. Le mélange restera 1h au thermocycleur à 42°C pour permettre la retro-transcription enzymatique. Les ADNc obtenus seront stockés à -20°C en attendant d’être utilisés pour la qPCR.

Etape 3 : qPCR en temps réel 2.3.3.3.

Avant tout chose, des mélanges individuels d’amorces sont réalisés pour chaque gène (= « mix amorces ») en mélangeant 2 µL d’amorce sens (100 µM) + 2 µL d’amorce anti-sens (100 µM) + 96 µL d’eau ultra-pure auto-clavée (concentration finale de chaque amorce : 2 µM). Les amorces sont commandées individuellement au préalable chez un fournisseur (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri) à la concentration désirée et stockées à -20°C. Le mélange réactionnel est réalisé à l’aide du kit « Brillant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix » (Agilent, La Jolla, California) dans des plaques 96 puits.

Dans chaque puits sont déposés :

 1 µL d’ADNc  2 µL de mix amorces

 17 µL de mélange réactionnel

Le mélange réactionnel consiste en un mélange d’eau ultra-pure autoclavée (7 µL par puits) et de tampon 2X (ou « Master Mix » à raison de 10 µL par puits). Le Master Mix est une solution préparée par le fournisseur comprenant les éléments nécessaires à la réaction de PCR : (1) la Taq polymérase ; (2) les dNTP ; (3) du Mg²⁺ pour l’action de l’enzyme ; (4) le SYBR Green I ; (5) un tampon d’activité. Un « No Template Control » (NTC) est réalisé pour chaque plaque afin de s’assurer de l’absence d’ADN dans l’eau utilisée pour la réalisation des mélanges réactionnels. Ce contrôle est constitué des

97 mêmes réactifs que les autres puits, avec l’amorce de l’actine et 1 µL d’eau ultra-pure à la place de l’échantillon.

La réaction de PCR a été réalisée dans un thermocycleur Mx3000P (Agilent, La Jolla, California). Le profil thermique est identique à celui décrit précédemment : 1 cycle de 10 min at 95°C (activation de l’enzyme) puis 40 cycles d’amplification composés chacun de 30 secondes à 95°C (dénaturation), 30 secondes à 55°C (hybridation) et 30 secondes à 72°C (élongation). Les Ct ont été obtenus par le logiciel MxPro – Mx3000P (Agilent, La Jolla, California).

La spécificité d’amplification des gènes d’intérêt est systématiquement vérifiée en fin de réaction par l’étude des courbes de fusion. Chaque amplicon présente en effet une composition spécifique en bases azotées (ATCG). Cette composition conditionne la température de dénaturation (température de fusion ou Tm) du double brin d’ADN. Ainsi, après les 40 cycles d’amplifications précédemment décrits, une dernière étape de chauffage est réalisée par l’appareil qui va enregistrer en continu la fluorescence entre 65°C et 95°C. Les températures auxquelles sont enregistrées des chutes soudaines de fluorescence correspondent aux seuils de dénaturation des amplicons : en se séparant, les doubles brins libèrent le SYBR Green I qui n’émet plus de fluorescence.

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