3 Les alginate lyases

IV-3-a Propriétés enzymatiques

Les polysaccharides lyases (PL, EC 4.2.2.-) constituent un groupe d'enzymes qui clivent les chaînes de polysaccharides contenant des acides uroniques par un mécanisme de -élimination. Afin de modéliser l'action de ces enzymes, on peut adapter la nomenclature utilisée pour les glycoside hydrolases (Davies et al., 1997). Ainsi, on définit au sein de la poche catalytique de ces enzymes des sous-sites de liaison au substrat (Figure 1-25). Par définition, le clivage de la chaîne à lieu entre le sous-site – 1 et le sous-site + 1. Les sous-sites

A

B

C

Figure 1-24 : Système d'import et de dégradation de l'alginate chez Sphingomonas sp.A1

A, B. Microscopie électronique de cellules cultivées sans alginate (A) ou avec (B). La présence d'alginate

induit la formation d'un pore dans la membrane, dont la structure est présentée sur le schéma C. D'après Hashimoto et al. (2010).

59

négatifs sont ceux du côté de la nouvelle extrémité réductrice, et les sous-sites positifs sont du côté de la nouvelle extrémité non-réductrice. Le clivage par une polysaccharide lyase génère un résidu uronique insaturé au soussite +1 et une nouvelle extrémité réductrice au soussite -1.

Le mécanisme d'action d'une alginate lyase ( -élimination) proposé pour la première fois par Gacesa (1987) est représenté sur la Figure 1-26 page suivante. Il n'implique pas l'hydrolyse par une molécule d'eau. La première étape est la neutralisation de la charge négative portée par le groupement carboxylate en C6 du résidu situé dans le sous-site +1 de l'enzyme. Pour cela, un pont salin est formé avec la chaîne latérale d'un acide aminé chargé positivement (AA1 dans la Figure 1-26) ou un cation divalent. Il y a ensuite abstraction du proton en C5 par la chaîne latérale d'un résidu agissant comme une base (AA2). Des acides aminés tels qu'un acide aspartique, un acide glutamique, une histidine, une lysine ou une cystéine ont été suggérés pour intervenir à cette étape. L'anion énolate créé est alors stabilisé par délocalisation de charge. Enfin, un proton est transféré sur l'oxygène de la liaison glycosidique. Cette étape est facilitée par l'apport d'un proton par un autre acide aminé catalytique. De manière alternative, le proton pourrait aussi être fourni directement par le solvant. Ceci aboutit à la formation d'une double liaison entre les carbones C₄ et C₅ du résidu dans le sous-site +1 et à l'élimination de la liaison glycosidique O 14. Que l'on parte d'un motif guluronate ou mannuronate, le motif obtenu à l'extrémité non-réductrice de

l'oligosaccharide est le même : l'acide uronique

4-désoxy-L-érythro-hex-4-enopyranosyluronique. Par convention, ce motif est noté delta ( ). Côté non réducteur Côté réducteur Substrat Enzyme -4 -3 -2 -1 +1 +2 +3 +4 Site de clivage

Figure 1-25 : Nomenclature des sous-sites dans une polysaccharidase.

60

La conjugaison entre la double liaison C4=C5 formée et le groupement carboxyl en C6

confère aux produits de la réaction un pic d'absorption en UV à 230-235 nm (Preiss and Ashwell 1962a). La réaction peut donc facilement être suivie au spectrophotomètre. Une autre méthode couramment utilisée est le test colorimétrique à l'acide thiobarbiturique (TBA), qui réagit avec les sucres insaturés pour donner un composé absorbant à 548 nm.

Comme je l'ai déjà mentionné, les alginate lyases peuvent cliver le polysaccharide soit en milieu de chaîne (mode d'action endolytique), soit en bout de chaîne (mode exolytique). La

Figure 1-26 : Mécanisme de -élimination d'une alginate lyase Schéma modifié d'après Svanem et al. (2001)

1

2

3

Neutralisation du groupe carboxylate

Abstraction du proton en C5

Stabilisation de l'anion par délocalisation de charge

Transfert d'un proton sur l'oxygène

Clivage de la liaison glycosidique O 14

Oligosaccharide insaturé

61

grande majorité des alginate lyases caractérisées possède un mode d'action endolytique (Wong et al., 2000). Quelques exo-alginate lyases ont été décrites, par exemple HdAlex chez

Haliotis discus hannai (Suzuki et al., 2006), A1-IV chez Sphingomonas sp. A1 (Hashimoto et al., 2000) ou Atu3025 chez Agrobacterium tumefaciens (Ochiai et al., 2006). De manière

intéressante, certaines enzymes peuvent changer de mode d'action, par exemple en fonction du pH (Ogura et al., 2009).

La diversité de structure de l'alginate, due à l'existence des deux types de motifs M et G et aux différents enchaînements possibles, se reflète dans la spécificité de substrat des alginate lyases. En effet, certaines clivent spécifiquement entre deux résidus G : on parle alors de guluronate lyases (EC 4.2.2.11). Il existe aussi des mannuronate lyases (EC 4.2.2.3) qui attaquent la liaison glycosidique entre deux motifs M. Certaines enzymes décrites comme plus spécifiques pour un type de motif peuvent tout de même présenter une activité résiduelle sur des homopolymères de l'autre motif (Wong et al., 2000).

La température optimale de la plupart des alginate lyases de bactéries marines est comprise entre 25°C et 50°C. Leur pH optimum varie généralement entre 7,0 et 8,5. La présence de cations (Na⁺, Ca²⁺ par exemple) peut être nécessaire voire indispensable à l'activité. Les cations pourraient jouer un rôle dans la stabilisation de l'intermédiaire énolate formé au cours de la réaction (Figure 1-26).

IV-3-b Classification et détermination structurale

Comme les autres enzymes actives sur les sucres (Carbohydrate-Active enZymes, CAZymes), les polysaccharides lyases sont recensées dans la base de données CAZy (http://www.cazy.org/, Cantarel et al., 2009). En avril 2011, 21 familles de PL sont recensées dans CAZy (PL1 à PL22, la famille PL19 ayant été reclassée dans les glycoside hydrolases). Cette classification hiérarchique est basée sur des similarités de séquences protéiques. Par conséquent, les familles reflètent plus un mécanisme d'action et un repliement commun qu'une spécificité de substrat. Pour tenter de faciliter la prédiction fonctionnelle des nouvelles PL trouvées dans les génomes, les familles de PL ont récemment été subdivisées en sous-familles (Lombard et al., 2010). Les auteurs ont ainsi créé 41 sous-sous-familles, et ont montré que 90% d'entre elles sont monospécifiques, c'est-à-dire contiennent des enzymes avec la même spécificité de substrat. La classification en sous-familles permet donc de prédire avec une

62

bonne confiance la spécificité de nouvelles enzymes non caractérisées. Cette prédiction doit toutefois être confirmée par des analyses biochimiques.

Les alginate lyases se répartissent dans 7 familles CAZy : PL5 (45 protéines), PL6 (36 protéines), PL7 (101 protéines), PL14 (49 protéines), PL15 (15 protéines), PL17 (47 protéines) et PL18 (6 protéines). A ce jour, seules des activités alginate lyases ont été démontrées pour ces familles, sauf dans PL6 qui contient aussi des chondroitinases. La majorité des alginate lyases caractérisées sont classées dans les familles PL5 et PL7 (Tableau 1-5).

Famille Repliement

Acides aminés catalytiques

Sous-famille Alginate lyases caractérisées Structures disponibles ^{Spécificité} Neutraliseur Base Acide

PL5 ( / )4 toroïde Arg/Asn Tyr Tyr 10 1

SF1 9 0 MM

N.C. 1 1 MM

PL6 Hélice Ca²⁺ Lys Arg 1 0

N.C. 1 0 MM

PL7 -Jelly roll Gln His Tyr 16 3

SF1 1 1 MG SF2 0 0 - SF3 2 1 GG SF4 0 0 - SF5 4 0 GG N.C. 9 1 MM, GG, MG PL14 -Jelly roll N.D. N.D. N.D. 4 1 SF1 1 1 glucuronate SF2 0 0 - SF3 2 0 MM N.C 1 0 MM

PL18 -Jelly roll Gln His Tyr N.C. 4 1 MM, GG

PL15 tonneau ( / )6 + sandwich

Arg His Tyr 4 1

SF1 3 1 - SF2 0 0 - N.C. 1 0 MM PL17 N.D. N.D N.D. N.D. 1 0 SF1 0 0 - SF2 1 0 MM

Tableau construit d'après les données recensées dans CAZy (http://www.cazy.org/) en avril 2011. D'après Lombard et al. (2010) et Garron et al. (2010)

63 Hélice PL6 ( / )₄toroïde PL5 ( / )₆toroïde + sandwich PL15 Sandwich incurvé PL7, PL14, PL18 A B C D

Figure 1-27 : Les 4 types de repliement connus dans les familles d'alginate lyases

A. A1-III de Sphingomonas sp.A1 (PDB 1HV6, Yoon et al., 2001). B. Chondroitinase B de P. heparinus (1DBG, Huang et al., 1999). C.A1-II' de Sphingomonas sp.A1 (2CWS, Yamasaki et al., 2005) D. Atu3025 d'A. tumefaciens (3AFL, Ochiai et al., 2010). Images générées dans PyMOL.

64

Dix alginate lyases ont été caractérisées biochimiquement dans la famille PL5. Elles ont toutes une préférence pour les blocs de motifs M. La structure de l'alginate lyase A1-III de

Sphingomonas sp. A1 a été résolue (Yoon et al., 2001). Cette protéine adopte un repliement

en toroïde incomplet ( / )4.(Garron and Cygler 2010) Elle est constituée d'une répétition de 4 paires d'hélices antiparallèles, qui forment des épingles (hairpins) (Figure 1-27 A). De courtes boucles séparent deux hélices d'une même épingle, alors qu'on trouve des connections plus longues entre deux épingles successives. Ces épingles sont arrangées en un demi-tonneau et forment une gorge dans laquelle se trouve le site actif. Les rôles d'acide et de base ont été attribués au même acide aminé, Tyr246, qui interviendrait donc deux fois dans le mécanisme catalytique. Le groupe carboxyl du sucre dans le sous-site +1 peut être neutralisé par l'arginine Arg239 et possiblement par Asn191 (Yoon et al., 2001).

Une alginate lyase a été caractérisée dans la famille PL6. Il s'agit d'AlyP de

Pseudomonas sp. OS-ALG-9 (Maki et al., 1993). La structure de cette protéine n'est pas

connue, mais celle d'une chondroitinase B de Pedobacter heparinus appartenant également à la famille PL6 a été déterminée. Du fait des similarités de séquences, on peut penser que les alginate lyases de la famille PL6 adoptent le même repliement. La chondroitinase possède une structure en hélice droite (Huang et al., 1999). Elle est constituée de trois feuillets , qui forment une hélice à 11 tours (Figure 1-27 B). Les feuillets PB1 et PB2 sont quasiment antiparallèles, et PB3 pratiquement perpendiculaire à PB2. Dans cette chondroitinase, un ion calcium joue le rôle de neutraliseur de la charge négative du groupement carboxylate (Michel

et al., 2004). Le résidu basique qui abstrait le proton en C5 est une lysine (Lys250) et une arginine (Arg271) joue le rôle du donneur de proton (Tableau 1-5).

Les enzymes des familles PL7, PL14 et PL18 partagent le même repliement en sandwich incurvé ( jelly roll). PL7 est la famille d'alginate lyases la mieux caractérisée, puisque l'activité a été démontrée pour 16 enzymes, dont trois de structures connues (Yamasaki et al., 2004; Osawa et al., 2005; Yamasaki et al., 2005; Ogura et al., 2008). La famille PL14 contient 4 alginate lyases caractérisées. La seule dont la structure est connue, l'enzyme virale vAL-1, clive les liaisons entre les résidus glucuronates du composé pariétal d'une micro-algue verte, mais présente une activité alginate lyase à pH basique (Ogura et al., 2009). La famille PL18 comporte quant à elle 4 alginate lyases caractérisées, dont une structuralement. Le repliement en jelly roll est constitué de deux feuillets antiparallèles, présentant une courbure approchant un angle de 90° en leur milieu (Garron and Cygler 2010)

65

(Figure 1-27 C). Ceci crée une gorge dans laquelle le substrat se fixe et où a lieu la catalyse. Deux boucles flexibles peuvent interagir entre elles par des liaisons hydrogène entre deux résidus asparagine et forment ainsi une structure de "couvercle" au-dessus de la gorge. Par mutagénèse dirigée, Ogura et al. (2008) ont montré que la flexibilité de ces deux boucles est essentielle à la liaison du substrat dans la gorge. Les résidus catalytiques ont été déterminés et sont identiques pour les enzymes des familles PL7 et PL18. Il s'agit d'une glutamine qui neutralise la charge du groupement carboxyl, d'une histidine jouant le rôle de base et d'une tyrosine donneuse de proton. Aucun de ces résidus n'est conservé dans la famille PL14. Par mutagénèse dirigée, des acides aminés importants pour l'activité et conservés au sein de la famille ont été mis en évidence (Ogura et al., 2009). Cependant, les acides aminés catalytiques n'ont pas encore été déterminés précisément.

Quatre alginate lyases ont été caractérisées dans la famille PL15. La structure de l'une d'entre elles est résolue, celle d'Atu3025 d'Agrobacterium tumefaciens (Ochiai et al., 2010). Elle adopte un repliement en trois domaines (Figure 1-27 D): un petit domaine N terminal en feuillet , un domaine ( / )₆ toroïde central et un domaine C terminal en sandwich . Les acides aminés catalytiques sont l'arginine R199 (neutraliseur), l'histidine H311 (base) et la tyrosine Y365 (acide).

Enfin, on ne compte qu'une seule alginate lyase caractérisée dans la famille PL17. Il s'agit de AlyII de Pseudomonas sp. OS-ALG-9 (Kraiwattanapong et al., 1999). Cette famille de polysaccharide lyases reste en grande partie méconnue. Aucun acide aminé catalytique n'a été proposé pour le moment, et aucune structure n'a été obtenue.

Indépendamment de la famille structurale à laquelle elles appartiennent, les enzymes agissant sur des polysaccharides peuvent adopter trois types de topologie différents: en forme de poche, de sillon ou de tunnel (Davies and Henrissat 1995). Dans la topologie en "poche", le site catalytique se trouve enfoui au fond d'une dépression de la surface moléculaire. Cette topologie est optimale pour la reconnaissance de l'une ou l'autre des extrémités d'une chaîne de polysaccharide. On la retrouve donc chez les enzymes agissant de manière exolytique. C'est par exemple le cas de l'alginate lyase Atu3025 d'Agrobacterium tumefaciens (Ochiai et al., 2010) (Figure 1-28A). La topologie ouverte en "gorge" ou "sillon" est adaptée à la fixation aléatoire le long de la chaîne du polysaccharide et est souvent retrouvée dans les endo-enzymes. Cette topologie est notamment celle de l'alginate lyase ALY-1 de Corynebacterium sp. (Osawa et al., 2005) (Figure 1-28B). La topologie en "tunnel" est dérivée de la précédente.

66

Les protéines qui l'adoptent possèdent de longues boucles qui peuvent venir refermer la gorge de fixation au substrat. Ceci permet aux enzymes de relâcher le produit de la réaction tout en restant fermement ancrées au polysaccharide, créant les conditions nécessaires à la processivité. Les boucles couvrant le tunnel peuvent être flexibles, ce qui autorise une ouverture du site de fixation pour une attaque initiale en milieu de chaîne. Notamment, l'alginate lyase A1-II' de Sphingomonas sp.A1 adopte ce type de topologie (Ogura et al., 2008) (Figure 1-28C).

Figure 1-28 : Exemple de topologies adoptées par les polysaccharidases

A. Topologie en poche de l'alginate lyase Atu3025 d'Agrobacterium tumefaciens (PDB n° 3AFL). B. Topologie

en gorge ouverte de l'alginate lyase ALY-1 de Corynebacterium sp. (PDB n° 1UAI). C. Topologie en tunnel de l'alginate lyase A1-II' de Sphingomonas sp. A1 (PDB n° 2ZAB). Les sites catalytiques et de fixation au substrat sont colorés en rouge. Figures générées dans PyMOL.

A. Poche

67

Outre leurs domaines catalytiques, les polysaccharidases peuvent posséder des modules structuraux auxiliaires appelés Carbohydrate Binding Modules (CBM). Un CBM est défini comme une séquence contiguë d'acides aminés au sein d'une enzyme active sur les sucres, qui se replie de manière indépendante et possède une activité de liaison aux sucres (Boraston et al., 2004). Dans la plupart des cas, un CBM fixe spécifiquement le substrat du domaine catalytique auquel il est associé. Dans le cas des familles polyspécifiques CBM6 et CBM32, il a été montré que les CBM ont co-évolué avec leur domaine catalytique vers une même spécificité de substrat (Abbott et al., 2008; Michel et al., 2009).Comme les modules catalytiques, les CBM sont également recensés dans la base de données CAZy (http://www.cazy.org/, Cantarel et al., 2009). A ce jour, deux familles de CBM ont été prédites dans des séquences d'alginate lyases. Il s'agit des familles CBM16 (dans AlyA de

Pseudoalteromonas atlantica, alyPEEC de Pseudoalteromonas sp. IAM14594 et Aly-SJ02 de Pseudoalteromonas sp. SM0524) et CBM32 (dans AlyPI de Pseudoalteromonas sp. CY24).

Cependant, la capacité de fixation de l'alginate n'a pas encore été démontrée pour ces modules.

IV-3-c Les applications des alginate lyases

Les alginate lyases ont trouvé des applications dans des domaines nombreux et variés. Elles sont utilisées comme outils enzymatiques pour élucider la structure fine des alginates. En effet, en analysant les produits de dégradation obtenus avec une enzyme de spécificité et de mode d'action connus, on peut déduire des informations sur la structure du polysaccharide de départ (Fujibaya et al., 1970; Min et al., 1977; Boyd and Turvey 1978; Ostgaard 1993). Les alginate lyases sont également des outils de choix pour dégrader la paroi des algues brunes en vue de la préparation de protoplastes, des cellules nues et viables. Des protoplastes ont pu être isolés chez une trentaine d'espèces de Phaeophyceae et utilisés notamment pour des études sur la synthèse de la paroi et la régénération d'un individu (Reddy et al., 2008). Ils pourraient également être des cibles intéressantes pour la transformation génétique qui n'est à ce jour pas possible chez les algues brunes.

L'usage des alginate lyases s'est aussi répandu pour la production d'oligosaccharides qui peuvent présenter différents effets physiologiques. En biologie végétale, il a été montré que des oligoalginates insaturés favorisent la germination et la croissance racinaire chez

68

différentes espèces de plantes terrestres (Murata et al., 1993; Natsume et al., 1994). Ils sont également capables d'éliciter des réponses de défense et pourraient donc être utilisés pour la protection des cultures (Akimoto et al., 1999; An et al., 2009). Les oligoalginates ont aussi un effet sur les cellules animales. Ils induisent par exemple la prolifération de kératinocytes in

vitro en présence du facteur de croissance EGF (Kawada et al., 1997). Ils stimulent la

production de cytokines chez la souris (Yamamoto et al., 2007) et sur des cellules humaines (Iwamoto et al., 2003). Des activités anti-tumorales ont pu être mises en évidence pour des dérivés oligoalginates sulfatés (Hu et al., 2004).

Une autre application thérapeutique des alginate lyases est envisagée dans le traitement de la mucoviscidose. Comme je l'ai déjà évoqué, les poumons de patients atteints de fibrose kystique sont infectés par une souche de Pseudomonas aeruginosa qui produit de l'alginate comme exopolysaccharide. En association avec de l'ADN excrété, il forme un mucus dense qui favorise l'adhésion des bactéries et les protège des cellules du système immunitaire et des antibiotiques (May et al., 1991). L'utilisation d'alginate lyases pour dégrader cette couche muqueuse pourrait rendre les bactéries plus accessibles et donc faciliter l'action des macrophages (Eftekhar and Speert 1988) et des antibiotiques (Hatch and Schiller 1998; Alkawash et al., 2006). Cette approche est encore en développement et comporte plusieurs limitations. Tout d'abord, l'alginate lyase utilisée doit être active sur l'alginate bactérien, qui est acétylé. Elle doit être tolérée par l'organisme et ne pas induire de réaction immunitaire. Sur ce point, il semble que la modification chimique des enzymes par du polyéthylène glycol soit une piste encourageante (Lamppa et al., 2011). Enfin, la dégradation du biofilm pourrait favoriser la dissémination de P. aeruginosa vers d'autres sites d'infection.

69