4 L'alginate : un composé majoritaire

II-4-a Structure chimique de l'alginate

L'alginate est un polysaccharide constitué de l'enchaînement de deux types d'acides

uroniques : l'acide -1,4-D-mannuronique (M) et son C-5 épimère l'acide

-1,4-L-guluronique (G). La seule différence entre les deux types de motifs est l'orientation du groupement carboxylique substitué en position 5. Il est au-dessus du plan de l'anneau saccharidique dans les motifs M et en-dessous dans les motifs G (Figure 1-10). La masse molaire d'un motif M ou G est de 194 g.mol^-1. L'alginate produit par certaines bactéries des familles Pseudomonadaceae et Azotobacteriaceae est par ailleurs acétylé sur les positions 2 et/ou 3 des motifs M.

Dans le polymère, deux unités successives sont liées entre la position 1 de la première et la position 4 de la seconde (Figure 1-11). L'arrangement des deux types de motifs M et G permet de distinguer trois types d'organisation de l'alginate : des blocs homopolymériques de

COO-O OH R-O ^HO R' COO-O OH R-O ^HO R' 1 2 3 4 5 6 COO-O OH R-O HO ^R' COO-O OH R-O HO ^{1 R'} 2 3 4 5 6 -D-mannuronate -L-guluronate

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motifs G [poly(G)], des blocs homopolymériques de motifs M ([poly(M)] et des blocs hétéropolymériques de motifs M et G. Ces derniers peuvent être constitués par l'alternance répétée de M et de G, ou par de courts blocs d'un type de motif séparés par un résidu de l'autre motif (Haug et al., 1967).

Figure 1-11 : Organisation d'un polysaccharide d'alginate

A. Liaisons possibles entre les deux types de motifs mannuronate (M) et guluronate (G). B. Les différents types

de blocs composant une molécule d'alginate.

Les trois types de blocs peuvent être présents dans une même molécule d'alginate, chaque bloc comportant 20 à 30 résidus. La masse molaire d'une chaîne entière peut atteindre 800 kDa, soit un degré de polymérisation de plus de 4000 résidus (Kloareg and Quatrano 1988). Les blocs poly(G) forment des structures rigides et compactes, avec une distance entre deux résidus de 8,7 Å (Figure 1-11 A). Du fait de leur conformation différente, les blocs poly(M) forment des régions en "rubans allongés" plus souples avec une distance inter-résidus de 10,3 Å. Les régions hétéropolymériques constituées de petits blocs d'un motif forment des chaînes brisées, alors que celles où M et G alternent régulièrement adoptent une conformation en sinusoïde (Wong et al., 2000). La variabilité structurale d'une chaîne d'alginate se joue donc à différents niveaux : le degré de polymérisation de la chaîne, l'abondance relative des deux types de motifs (ratio M/G) et leur enchaînement.

8,7 Å O O O ^O O O O H O H O H -OO C -OO C O -O O C O H O H O O H -O O C O H O H O O H -OO C O H 10,3 Å

Blocs homopolymériques : poly(G): GGGGGGGGGGGGGGGG

poly(M): MMMMMMMMMMMMMM Blocs hétéropolymériques : MGMGMGMGMGMGMGMG MMMGMMMMGMMMMGMG GGGGMGGGMGGGGGMGG

G G M M G

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II-4-b La biosynthèse des alginates

Les étapes de la biosynthèse de l'alginate et les enzymes impliquées sont bien connues chez deux espèces de Gammaprotéobactéries qui en produisent, Pseudomonas aeruginosa et

Azotobacter vinelandii (Rehm and Valla 1997; Ramsey and Wozniak 2005). Le

fructose-6-phosphate est à la base de la voie de synthèse (Figure 1-12). Il est converti en acide mannuronique-guanoside diphosphate (GDP-ManA) en quatre étapes catalysées par les enzymes AlgA (bifonctionnelle, mannose-6-phosphate isomérase et mannose-1-phosphate

guanylyltransférase), AlgC (phosphomannomutase) et AlgD (GDP-mannose

6-déshydrogénase). Le nucléotide-ose GDP-ManA est la forme activée de l'acide mannuronique et le précurseur de l'alginate. L'enzyme Alg8 (mannuronane synthase) catalyse la polymérisation du GDP-ManA et synthétise donc des chaînes homopolymériques poly(M). Certains résidus M peuvent alors être convertis en motifs G par l'épimérisation du groupement carboxyl en position C5. Cette réaction qui a lieu au niveau du polymère est catalysée par la C5-épimérase AlgG. Suite à ce processus, on obtient donc une molécule d'alginate complexe dont le ratio M/G et l'enchaînement des deux motifs dépendent du mode d'action et de l'activité de la C5-épimérase. Fructose-6-P Mannose-6-P Mannose-1-P GDP-Mannose Acide mannuronique - GDP Mannuronane Alginate Bactéries P. aeruginosa Algues brunes E. siliculosus 1 2 3 4 5 6 AlgA AlgC AlgD AlgA Alg8 AlgG ma nnose-6-phosphate isoméra se phosphomannomutase ma nnose-1-phosphate gua nylyltra nsféra se

GDP-ma nnose 6-déshydrogéna se ma nnuronane synthase

C5-épiméra se

pas d'homologue

4 protéines ca ndida tes

1 homologue pas d'homologue

a ctivité démontrée chez Fucus

4 homologues pas d'homologue

2 protéines ca ndida tes

28 homologues

GGMMMGMGGGMMMG

Figure 1-12 : La voie de biosynthèse de l'alginate chez les bactéries (Pseudomonas aeruginosa) et les algues brunes (Ectocarpus siliculosus)

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Il a été montré que la synthèse de l'alginate implique des réactions biochimiques équivalentes chez les algues brunes (Lin and Hassid 1966; Haug and Larsen 1969). Le récent séquençage du premier génome d'algue brune, celui d'Ectocarpus siliculosus, a permis d'apporter des informations sur les gènes potentiellement impliqués dans cette voie de biosynthèse (Cock et al., 2010; Michel et al., 2010). Des homologues des protéines bactériennes AlgC, AlgD et AlgG ont été trouvés. Notamment, la protéine Esi 016-0053 a été prédite comme une GDP-mannose déshydrogénase (Michel et al., 2010). Son activité a récemment été confirmée grâce à l'expression hétérologue de la protéine chez E. coli (Tenhaken et al., 2011). Aucun homologue de la mannuronane synthase Alg8 n'a pu être détecté dans le génome. Cependant, E. siliculosus possède deux protéines appartenant à la même famille que Alg8 (glycosyltransférase 2, GT2) et qui pourraient catalyser la polymérisation du GDP-ManA. De même, la protéine bifonctionnelle AlgA n'a pas d'homologue chez E. siliculosus. Les réactions 1 et 3 de la voie de biosynthèse (Figure 1-12) pourraient être catalysées par des enzymes différentes, monofonctionnelles. Ainsi, E.

siliculosus possède 4 homologues de mannose-6-phosphate isomérases animales, qui

convertissent le fructose-6-phosphate en mannose-6-phosphate et pourraient jouer le même rôle chez les algues. Par contre, aucune protéine candidate n'a pu être proposée pour catalyser l'activation du mannose-1-phosphate en GDP-mannose. Cette activité a cependant été détectée chez le genre Fucus, et doit donc être codée par un gène appartenant à une nouvelle famille (Michel et al., 2010).

II-4-c Propriétés des alginates

Sous forme soluble, les alginates ont la propriété d'augmenter fortement la viscosité de solutions aqueuses. Ceci est dû à des contraintes empêchant la libre rotation autour des liaisons glycosidiques, qui augmentent selon le schéma suivant : MG < MM < GG. Les régions riches en blocs poly(M) et poly(G) sont donc plus rigides que celles où les deux types de motifs sont alternés. Une solution d'alginate riche en blocs homopolymériques poly(G) sera donc la plus visqueuse. D'autre part, l'alginate en solution peut être modélisé comme une succession de tiges raides (blocs homopolymériques) assemblées par des zones flexibles (blocs hétéropolymériques alternés). La solubilité de l'alginate dépend du pH de la solution car il détermine la présence de charges électrostatiques sur les résidus uroniques. Les constantes de dissociation (pK_a) pour les motifs M et G sont de 3,38 et 3,65, respectivement.

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Le pK_a du polymère est similaire. Une baisse brutale du pH en-dessous du pK_a provoque la précipitation de l'alginate (Haug and Larsen 1963).

Les sels d'acide alginique avec des ions monovalents (ex. Na⁺ et NH4⁺) sont solubles. En revanche, l'alginate gélifie en présence de cations divalents ou multivalents, et en particulier de Ca²⁺. Haug (1961) a démontré que l'affinité de l'alginate pour différents cations divalents (tels que Ca²⁺, Pb²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, etc.) augmente avec la proportion de motifs G dans l'alginate. La plus grande affinité des motifs G pour les cations divalents s'explique par la conformation en "zigzag" adoptée par les blocs poly(G).

O O O -O O C O H O H O O H -O O C O H O O O O H O H O O H O H -OOC -OOC

G G

G G

Figure 1-13 : Les propriétés gélifiantes des alginates

A. Liaison d'un ion Ca²⁺ dans la poche formée de motifs guluronates (G) selon le modèle des boîtes à œufs. D'après Donati et Paoletti (2009). B. Représentation schématique de la gélification de l'alginate en présence de calcium. D'après Christensen et al. (1990). C. Gels obtenus à partir d'alginate riche en motifs M (en rouge) ou G (en bleu) Photo : Kimica Corporation.

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En présence de calcium (ou d'autres cations divalents de taille similaire), des connections inter-chaînes s'établissent entre des blocs poly(G) de différentes molécules d'alginate. L'alignement de deux blocs poly(G) crée des cavités où un ion Ca²⁺ peut venir se loger. Cette description du processus de gélification est connue sous le nom de modèle "en boîte à œufs" (egg-box model), dans lequel les œufs sont les cations divalents emprisonnés dans les boîtes constituées des motifs G (Figure 1-13A).

Le ratio M/G et l'enchaînement des différents types de motifs conditionnent donc les propriétés mécaniques des gels d'alginate. Les alginates riches en guluronate forment des gels durs, cassants et résistants à chaleur. Les alginates riches en mannuronate forment quant à eux des gels plus souples et élastiques (Figure 1-13 C).

II-4-d Variations biologiques de la composition en alginate

Comme décrit précédemment, la synthèse d'alginate dans les parois des algues brunes est un processus finement contrôlé. Le ratio M/G et la position des différents motifs sont contrôlés par l'action des C5-épimérases. Ces paramètres conditionnent les performances mécaniques du polymère, et leurs variations reflètent des propriétés de paroi différentes (élasticité, résistance, etc.). Il n'est donc pas surprenant de trouver des variations biologiques de la composition des alginates.

En effet, la proportion d'alginate dans la paroi et le ratio M/G varient selon l'espèce d'algue brune considérée (Tableau 1-2). Cependant, ces variations sont difficiles à relier à la taxonomie (Kloareg and Quatrano 1988).

Tableau 1-2 : Proportion de motifs M et G dans des alginates de différentes sources

Proportions de motifs guluronates (F_G) et mannuronates (F_M) déterminées par spectroscopie RMN. D'après Draget et al. (2005).

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Au sein d'un même individu, le ratio M/G de l'alginate change en fonction de la partie de l'algue. Ainsi, les frondes possèdent un alginate plus riche en mannuronate, et donc plus souple. Les stipes et les crampons, qui servent de point d'ancrage au substrat rocheux, possèdent un alginate plus riche en guluronate ce qui leur confère une grande rigidité et une meilleure résistance aux stress mécaniques (Haug et al., 1974a). Les tissus âgés sont en général plus riches en motifs G, ce qui traduit l'action de C5-épimérases au cours du temps. Ceci est à relier avec les variations saisonnières qui peuvent être observées. Par exemple, chez

Undaria pinnatifida, des suivis de la production d'alginate au cours du temps ont montré que

celle-ci augmente de mars à juillet. L'alginate extrait des jeunes plantules collectées au mois de mars contient principalement des blocs poly(M), et la proportion de motifs G augmente au cours du printemps et de l'été au fur et à mesure que les algues grandissent (Skriptsova et al., 2004). La composition de l'alginate répond également aux conditions environnementales. Ainsi, les algues qui poussent dans un milieu très battu ont généralement un contenu en alginate plus élevé que celles vivant dans des eaux plus calmes (Craigie et al., 1984). D'autre part, il a été montré que la culture en présence de fortes concentrations en phosphate ou en métaux lourds influence la production d'alginate et augmente le taux de guluronate (Indergaard and Skjakbraek 1987; Andrade et al., 2010).

II-4-e Les applications des alginates

Les propriétés physico-chimiques intéressantes des alginates ont trouvé de multiples applications dans des domaines comme l'industrie textile, agro-alimentaire ou pharmaceutique. La demande en alginate est importante et la production est de l'ordre de 30000 tonnes par an. Tous les alginates commerciaux sont extraits d'algues brunes, principalement des genres Laminaria, Macrocystis, Lessonia et Ascophyllum (Tableau 1-3).

Genre Récolte (tonnes humides / an) %

Laminaria 43500 34% Macrocystis 35000 28% Lessonia 20500 16% Ascophyllum 20000 16% Durvillaea 4500 3,5% Ecklonia 3000 2,5% TOTAL 126500

Tableau 1-3 : Masses d'algues récoltées dans le monde en 2001 D'après McHugh (2003).

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La grande majorité de la biomasse algale utilisée est obtenue à partir de populations sauvages. La récolte peut encore se faire à la main pour certaines espèces (notamment

Ascophyllum), même si la majeure partie est aujourd'hui réalisée mécaniquement sur des

bateaux spécialement équipés. Ce prélèvement important dans les champs d'algues nécessite une gestion raisonnée des stocks afin de ne pas épuiser la ressource. Il n'existe que très peu de fermes de cultures d'algues brunes. On note cependant la culture de Saccharina japonica en Asie pour des utilisations alimentaires.

L'alginate est extrait de la paroi des algues brunes par un processus chimique, le but étant d'obtenir de l'alginate de sodium en poudre sèche. Le principe est de convertir tous les sels d'alginate présents dans la paroi en alginate de sodium, qui est soluble dans l'eau. Ceci est possible en ajoutant du carbonate de sodium à un broyat d'algues. Il existe ensuite deux méthodes pour extraire l'alginate de sodium de la solution aqueuse. Dans la première, on fait précipiter l'alginate par ajout d'acide et on élimine une partie de l'eau présente dans les "flocons" obtenus. Dans la deuxième méthode on utilise du chlorure de calcium pour obtenir des fibres d'alginate gélifié. Un traitement à l'alcool et au carbonate de sodium permet de récupérer l'alginate de sodium sous forme de pâte qui peut alors être séchée (McHugh 2003). Le coût de production de l'alginate varie en fonction du degré de pureté souhaité. Des alginates peu raffinés, contenant encore des traces de débris d'algues, peuvent être obtenus pour 1 dollar US par kg. Ce coût peut monter jusqu'à 5 dollars par gramme pour des alginates ultra-purs utilisés dans des applications médicales (Draget et al., 2005).

Les applications des alginates sont multiples. L'industrie agro-alimentaire consomme approximativement 50% de la production. L'alginate est utilisé comme additif alimentaire pour améliorer, modifier et stabiliser la texture des préparations (numéros E400 à E405). Pour éviter la précipitation de l'alginate de sodium en milieu acide, on utilise un de ces dérivés, le propylène glycol alginate (PGA). Les propriétés épaississantes de l'alginate sont utiles pour obtenir des sauces et sirops plus consistants. Les émulsions eau-huile, telles que la mayonnaise ou la vinaigrette industrielles, sont moins susceptibles de se séparer en deux phases si on y ajoute de l'alginate. L'alginate permet également de garder en suspension la pulpe dans les jus de fruits, et le chocolat dans les boissons au cacao. Il évite la formation de cristaux désagréables en bouche dans les sorbets et crèmes glacées. De petites quantités de PGA ajoutées à la bière donnent une belle mousse stable durant plus longtemps. Les propriétés gélifiantes de l'alginate sont aussi largement exploitées par l'industrie alimentaire.

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Les premières cerises artificielles (des billes d'alginate de calcium parfumées et colorées) datent de 1946. Ce principe a depuis été repris et est à la base, par exemple, de la garniture des olives fourrées au piment, de pièces de viandes reconstituées, de desserts gélifiés, etc. Il inspire également les plus grands chefs de la "nouvelle cuisine" (Figure 1-14).

L'alginate est d'autre part utilisé dans l'industrie textile et dans les imprimeries comme épaississant pour les encres. Sa forte affinité pour les cations divalents en fait un bon agent pour absorber les pollutions par des métaux lourds (Davis et al., 2003). Son usage est répandu dans les cosmétiques (dentifrices, crèmes de beauté), toujours comme texturant. Dans le domaine médical, on exploite les fibres d'alginate de calcium en tant que pansement pour des blessures. Ces fibres peuvent être facilement absorbées par l'organisme, puisque le calcium est lentement échangé contre le sodium des fluides corporels, donnant un alginate soluble. Des substances actives comme des médicaments peuvent être encapsulées dans des billes d'alginate qui, une fois avalées, vont les libérer (Matricardi et al., 2008). Des mélanges alginate / chitosane peuvent être utilisés pour améliorer les propriétés mécaniques des microsphères. De telles billes d'alginate peuvent aussi servir à délivrer de l'ADN lors de thérapies géniques (Pannier and Shea 2004) ou même des cellules vivantes, dans le cadre de

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traitements de cancers (Hao et al., 2005), de diabètes (Basta et al., 1995), et d'essais de transplantations neuronales pour soigner la maladie de Parkinson (Yasuhara and Date 2007).

II-5 Rôle de la paroi des algues brunes dans l'interaction avec les