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cas pour le PSGR (récepteur couplé aux protéines G spécifique de la prostate), un RCPG qui sert de biomarqueur pour les cancers de la prostate (Xu et al., 2000). Un autre exemple de RCPG servant de biomarqueur est EMR2 (EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 2). Son expression est corrélée positivement avec la survie des patients atteint de cancer du sein métastatique (Davies et al., 2011).
Afin d’approfondir notre connaissance de l’implication des RCPG dans la physiopathologie des cellules souches cancéreuses de glioblastome et de trouver des RCPG pouvant servir de biomarqueurs, nous avons entrepris l’étude du profil d’expression de 356 RCPG appartenant principalement aux endoRCPG avec deux objectifs :
- Comparer le répertoire des RCPG exprimés dans différents types de cellules cancéreuses et non cancéreuses, et notamment dans les cellules souches cancéreuses de glioblastomes TG1 et OB1, la lignée U-87 MG de glioblastomes, des cellules souches neurales fœtales humaines (f-NSC) et des astrocytes humains (HA).
- Mettre en évidence des RCPG différentiellement exprimés en fonction de l’état de quiescence des cellules souches cancéreuses TG1 (TG1 proliférantes vs. TG1 quiescentes) par suivi de la mise en quiescence des cellules
3.2. Etude du transcriptome RCPG dans les CSC
Afin de réaliser les objectifs précédemment définis, les ARN totaux des cellules souches cancéreuses de glioblastomes TG1 et OB1, de la lignée de cellules de glioblastomes (U-87 MG), des cellules souches neurales fœtales humaines (f-NSC) et des astrocytes humains (HA) ont été extraits puis rétrotranscrits en ADN complémentaire. Les PCR quantitatives ont été réalisées sur l’appareil ABI Prism® 7900HT d’Applied Biosystems™ à l’aide des cartes TaqMan® human GPCR Array Card d’Applied Biosystems™. Ces cartes permettent l’étude de l’expression de 356 gènes codant des RCPG, principalement des endoRCPG, 2 gènes de la famille LANCL (LANCL1 et LANCL2) que nous ne considérons pas comme des RCPG, 15 gènes de contrôle (gènes de ménage) et 8 autres gènes non reliés aux RCPG. La liste des gènes est disponible en annexe II. Chaque échantillon a été testé en duplicata et des PCR quantitatives ont été refaites pour confirmer certains résultats obtenus avec les cartes. L’analyse des résultats nécessite de connaitre le meilleur contrôle (gène de référence) à utiliser parmi ceux présents sur la carte.
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Ce contrôle est défini comme étant celui qui est le plus stable dans tous les types cellulaires testés, selon les recommandations exposées au paragraphe 2.1.2.2 (Gresner et al., 2011).
Nous avons étudié la variabilité de 15 des gènes de contrôles proposés sur les cartes par un graphique dit « boîte à moustache ». Ce graphique montre la dispersion des données de séries statistiques, chaque série étant représentée par une boîte. Le graphique (figure 31) montre, pour chaque gène contrôle proposé la distribution des Ct (cycle seuil) pour les différentes études, tout type cellulaire confondu. Les boîtes à moustaches ont été réalisées avec l’ensemble des données et tiennent compte de la variation pour chaque type cellulaire testé. Le gène ayant la boîte à moustache la moins étendue est celui qui a les Ct qui varient le moins selon le type cellulaire étudié. Ainsi, on remarque que l’ARN ribosomique 18s, classiquement utilisé comme contrôle dans l’analyse des qPCR, est le moins stable en fonction du type cellulaire pour cette étude. Son utilisation est donc exclue pour cette analyse, bien qu’il ait pu être utilisé comme référence pour l’analyse de la transcription des gènes marqueurs du caractère souche des cellules (voir paragraphe 2.1.2.2). Il avait, pour cette analyse, la transcription la plus stable en fonction du type cellulaire étudié, parmi les gènes contrôles proposés sur la carte TaqMan® Human GPCR Array Card d’Applied Biosystems™. Les gènes RPLP0 (protéine P0 de la grande sous-unité 60s du ribosome) et
TBP (protéine de liaison à la boîte TATA) sont les gènes dont la transcription présente le
moins de variation dans les différents types cellulaires utilisés pour nos études. Cependant, seul RPLP0, dont le cycle seuil (Ct) est de 21,1, a été choisi comme contrôle pour nos analyses. RPLP0 est exprimé environ 6000 fois moins que l’ARN ribosomique 18s.
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Figure 31 : Détermination du meilleur gène rapporteur pour l’analyse de la transcription des RCPG par un graphique de boîte à moustaches.
Ce graphique représente la variation des gènes contrôles présents sur les TaqMan® GPCR
Array Card d’Applied Biosystems™. La série statistique pour chaque gène est donnée par la
valeur des cycles seuils (Ct) pour les duplicatas de chaque type cellulaire testé pour
l’ensemble des études de transcriptome RCPG réalisées au laboratoire dans le cadre de cette
étude. Chaque gène est représenté par une boîte à moustaches (voir légende de la figure 25).
Ici, les gènes présentant le moins de variabilité codent RPLP0 (protéine P0 de la grande
sous-unité ribosomique) et TBP (protéine de liaison à la boîte TATA).
Abréviations : 18s, ARN ribosomique 18s ; GAPDH, glycéraldéhyde-3-phosphate
déshydrogénase ; ACTB, actine β ; PPIA, peptidylpropyl isomérase A ; PGK1,
phophoglycérate kinase 1 ; B2M, β2-microglobuline ; GUSB, glucuronidase β ; HPRT1,
hypoxanthine phosphoribosyltransférase 1 ; TFRC, récepteur de la transférine ; HMBS,
hydroxyméthylbilane synthase ; IPO8, importine 8 ; POLR2A, grande sous-unité de l’ARN
polymérase II ADN dépendante ; PHGDH, phosphoglycérate déshydrogénase ; HDAC3,
histone déacétylase 3 ; RARS, aminoacyl ARNt synthétase.
3.2.1. Répertoire des RCPG exprimés dans deux lignées de cellules
souches cancéreuses de glioblastomes. Comparaison à
l’expression dans d’autres lignées de cellules cancéreuses et
non cancéreuses.
Une première étude de transcriptome visait à caractériser les RCPG exprimés dans les cellules souches cancéreuses de glioblatomes en comparaison de ceux exprimés dans la lignée de glioblastome U-87 MG et dans des cellules non cancéreuses. Compte tenu de l’importance des RCPG dans la signalisation cellulaire, cette étude pourrait conduire à l’identification de voies dérégulées dans ces cellules et éventuellement de biomarqueurs. A
RARS HDAC 3 PHGD H POLR 2A IPO8 HM BS TFRC TBP HPRT 1 GUSB B2M PGK1 PPIA ACTB RPLP 0 GAPD H 18s 40 30 20 10 0
C
yc
le
s
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u
il
(C
t)
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l’aide des cartes RCPG TaqMan® Array Card d’Applied Biosystem™, nous avons réalisé une étude de l’expression des gènes RCPG dans les cellules TG1 et OB1, deux des quatre types de cellules souches cancéreuses issues de glioblastomes que nous avons au laboratoire, et nous les avons comparé à l’expression des mêmes gènes dans les cellules U-87 MG de glioblastomes, les cellules f-NSC et des astrocytes humains (HA). Chaque type cellulaire a été testé en duplicata sauf les f-NSC qui ont été testées en triplicata. Les cellules TG1 testées, sont des cellules en prolifération, se trouvant aux 8ème et 23ème passages en culture. Les cellules OB1 sont au passage 20, les cellules HA sont au passage 5, les cellules U-87 MG sont au passage 10 et les cellules souches neurales fœtales (f-NSC) ont été testées deux fois au passage 15 et une fois au passage 20.
Les résultats d’expression des RCPG, normalisés par rapport au contrôle RPLP0, sont présentés en valeurs relatives par rapport à la limite de détection fixée pour notre expérience qui est de 31,5 Ct (Ct : cycle seuil). Cette limite a été déterminée en fonction du bruit de fond constaté pour nos données. Au-delà de ce seuil (Ct > 31,5), la fluctuation sur la mesure d’expression des gènes est très importante et il est hasardeux de se prononcer sur les variations d’expression de ces gènes, compte tenu du nombre de réplicas utilisés pour les expériences. L’expression des gènes est donc calculée selon la formule :
où ∆Ct représente la normalisation des cycles seuils pour chaque RCPG, par rapport au contrôle RPLP0.
et 31,5 est la valeur de détection limite fixée dans le cadre de notre étude.
Nous avons retenu pour notre étude, les RCPG qui présentent une expression relative supérieure ou égale à 1, dans au moins un des cinq types cellulaires testés (soit une valeur de Ct inférieure ou égale à 31,5 dans au moins un des types cellulaires). L’analyse montre que 138 RCPG répondent à ce critère. Les autres RCPG de la carte TaqMan® GPCR Array Card ne sont pas exprimés ou sont exprimés à un taux inférieur au seuil que nous nous sommes fixés dans cette analyse. La plupart des RCPG exprimés dans ces cellules le sont dans une gamme allant de moyennement exprimé (expression relative comprise entre 10 et 100) à peu exprimés dans les cellules testées (expression relative comprise entre 1 et 10), comparé au niveau d’expression des gènes de ménage (expression relative généralement supérieure à 200). Parmi les 138 gènes exprimés, 83 gènes sont exprimés dans les cellules TG1, 90 dans les cellules OB1, 77 dans les cellules f-NSC, 61 dans les cellules HA et 57 le sont dans les cellules U-87 MG (voir expression des RCPG
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dans les différents types cellulaires en annexe). Les RCPG les plus exprimés dans les différents types cellulaires sont LPHN2 (latrophiline 2) et GPR56 (récepteur 56 couplé aux protéines G) dans les cellules TG1 ; RGR (récepteur rétinal couplé aux protéines G), F2R (récepteur de la thrombine), GPR56, FZD7 (Frizzled 7) et LPHN2 dans les cellules OB1 ; GPR56, FZD3 (Frizzled 3) et GPRC5B (récepteur couplé aux protéines G famille C, groupe 5, membre B) dans les cellules f-NSC ; BDKRB2 (récepteur B2 de la bradykinine) et GPR56 dans les cellules U-87 MG et FZD1 (Frizzled 1) et FZD7 dans les astrocytes humains (tableau 6). GPR56 est donc très exprimé dans tous les types cellulaires cancéreux testés (TG1, OB1 et U-87 MG), mais aussi dans les cellules f-NSC, les cellules souches non tumorales (figure 32). GPR56 est exprimé très faiblement, proche de la limite de détection fixée, dans les astrocytes humains (expression relative inférieure à 2).
Figure 32 : Expression de GPR56 dans les différents types cellulaires