Identification de gènes spécifiques des différents types cellulaires cellulaires

Le but de cette étude était d’identifier des RCPG spécifiquement exprimés dans certains types cellulaires, dont les CSC issues de glioblatomes (TG1 et OB1), les cellules souches neurales fœtales (f-NSC), la lignée cellulaire de glioblastomes (U-87 MG) et les astrocytes humains (HA). Nous avons pu identifier 21 gènes de RCPG surexprimés dans les cellules à caractère souche (TG1, OB1 et f-NSC) par rapport aux deux autres types cellulaires testés, 8 gènes RCPG surexprimés dans les cellules souches cancéreuses (TG1 et OB1) par rapport aux trois autres types cellulaires testés et un autre RCPG spécifiquement sous-exprimé dans les cellules TG1 et OB1 par rapport aux 3 autres types cellulaires testés. Les RCPG ressortant de notre analyse sont reliés à des fonctions métaboliques, des activités pro-angiogéniques, la prolifération cellulaire, la résistance à l’hypoxie, l’interaction avec le microenvironnement. Ces propriétés permettent justement à ces cellules souches cancéreuses de se développer dans un microenvironnement spécifique, créé par la tumeur et qui peut induire la mort des cellules neurales normales.

Le clustering hiérarchique montre que chaque type cellulaire semble avoir son propre sous-ensemble de gènes RCPG surexprimés par rapport aux autres types cellulaires testés. Ce clustering (figure 33) nous permet en plus, d’observer les degrés de proximité des différents types cellulaires. Ainsi, TG1 et OB1 sont très proches en termes d’expression des RCPG. De même pour HA et U-87 MG qui semblent exprimer un certain nombre de RCPG à des niveaux similaires. Les cellules f-NSC sont légèrement à part.

Cependant, ce clustering ne permet pas de bien mettre en avant les groupes de gènes surexprimés préférentiellement dans les cellules à caractère souche vs. les cellules différenciées, les cellules cancéreuses vs. les cellules saines et les cellules souches cancéreuses vs. les autres cellules. Pour cela, une analyse complémentaire plus détaillée a été réalisée.

Le premier RCPG qui ressort clairement de cette analyse est GPR56 car il fait partie des RCPG les plus exprimés dans les cellules TG1, OB1, U-87 MG et f-NSC (tableau 6) et n’est que très faiblement exprimé dans les astrocytes humains (expression relative de 1,2±0,1). GPR56 est une protéine membranaire de la famille des RCPG d’adhésion qui joue un rôle dans le développement cérébral, notamment dans la migration des progéniteurs neuraux où il est fortement exprimé (Luo et al., 2011). Nos observations, qui montrent que GPR56 est plus exprimé dans les f-NSC par rapport aux 4 autres types cellulaires testés, vont dans le sens de cette publication et laissent suggérer que GPR56 pourrait être un

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biomarqueur des cellules souches neurales. GPR56 est également surexprimé dans les tumeurs et notamment les gliomes, comparé au tissu sain (Shashidhar et al., 2005). Dans les cellules de mélanome, GPR56 semble capable d’inhiber la production de VEGF, réduisant ainsi l’angiogenèse induite par les mélanomes (Yang et al., 2011a). D’autre part, la surexpression de GPR56 dans des cellules de mélanome est inversement proportionnelle au potentiel métastatique des cellules. En effet, les ARN messagers de GPR56 sont sous-exprimés dans des cellules de mélanomes hautement métastatiques par comparaison à des cellules de mélanome faiblement métastatiques et des expériences d’inhibition de GPR56 par siRNA provoque un accroissement de la tumeur et des métastases pour un modèle in

vivo de mélanomes (Xu et al., 2006). Notre analyse montre que les cellules TG1 OB1 et

U-87 MG (trois types de cellules tumorales) présentent des taux similaires d’ARNm de GPR56. Ces trois types cellulaires pourraient donc avoir un même potentiel métastatique.

GPR56 pourrait donc être un biomarqueur de l’état souche des cellules dans le cas de cellules saines. Il pourrait également être un biomarqueur du potentiel métastatique des cellules tumorales. Des études complémentaires sont nécessaires afin d’évaluer le rôle de ce récepteur dans la physiopathologie des cellules cancéreuses qu’elles aient des propriétés souches ou non.

Des 21 RCPG surexprimés dans les cellules à caractère souche comparé aux autres types cellulaires, CXCR4 (récepteur 4 à motif C-X-C) semble le plus intéressant car il est déjà identifié comme une cible thérapeutique potentielle contre les glioblastomes. En effet, son implication dans le phénomène angiogénique en fait une cible thérapeutique intéressante dans le traitement des cancers (Tseng et al., 2011). De plus, il a été montré qu’un antagoniste de CXCR4 (AMD 3100) inhibe la croissance des xénogreffes de glioblastomes in vivo, et la migration de cellules souches cancéreuses issues de glioblastome in vitro (Schulte et al., 2011). D’autre part, le même antagoniste a montré des actions inhibitrice sur la sécrétion de VEGF par les cellules souches cancéreuses de glioblastomes et a des actions inhibitrices de l’angiogenèse et de la croissance des xénogreffes des mêmes cellules (Ping et al., 2011). CXCR4 est également impliqué durant la régénération des tissus lésés. Il est exprimé à la surface des cellules souches et progéniteurs neuraux pour les guider jusqu’au site inflammatoire de la lésion qui génère un gradient de CXCL12, son ligand (Imitola et al., 2004). L’expression de CXCR4 ayant été démontrée dans les cellules souches cancéreuses issues de glioblastomes, il n’est pas surprenant de trouver CXCR4 surexprimé dans les cellules TG1 et OB1.

Nos données montrent que CXCR4 est 2 à 3 fois plus exprimé dans les cellules souches cancéreuses de glioblastome que dans les cellules souches neurales fœtales

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normales et n’est pas exprimé dans les U-87 MG et dans les HA. CXCR4 est donc une cible thérapeutique intéressante dans le cadre des glioblastomes. La confirmation de l’absence d’expression de CXCR4 dans d’autres lignées cellulaires de glioblastomes et de l’expression de CXCR4 dans d’autres types de CSC pourrait faire de ce RCPG un bon biomarqueur du degré de différenciation des tumeurs, permettant ainsi de prédire l’agressivité de la tumeur.

Parmi les gènes surexprimés dans les CSC de glioblastome TG1 et OB1, LPHN2,

GPR37 et HRH2 sont 3 RCPG qui ressortent de l’analyse détaillée.

LPHN2 (latrophiline 2, parfois appelé LPHH1 pour homologue 1 de la latrophiline) est un RCPG exprimé de manière ubiquitaire (Matsushita et al., 1999). Dans notre étude, LPHN2 est exprimé dans les 5 types cellulaires, mais ce RCPG est largement surexprimé dans les CSC TG1 et OB1. Cette surexpression spécifique de LPHN2 dans les CSC pourrait être liée avec le rôle de ce RCPG dans les transitions épithélio-mésenchymateuses (TEM). En effet, la perte du signal induit par LPHN2 pendant le processus de TEM inhibe la TEM dans un modèle ex vivo de tissu cardiaque de poulet (Doyle et al., 2006). Bien que LPHN2 ne soit pas exprimé exclusivement dans des cellules qui subissent une TEM, sa présence et sa voie de signalisation semblent requises dans le processus de transition épithélio-mésenchymateuse. Comme décrit dans le paragraphe 1.3.2 (introduction), des cellules cancéreuses de sein qui subissent une TEM de type 3 (TEM qui intervient dans les cellules cancéreuses) acquièrent des propriétés d’auto-renouvellement. Les TEM de type 3 peuvent donc ainsi induire un enrichissement d’une population de cellules cancéreuses en cellules souches cancéreuses (Mani et al., 2008; Morel et al., 2008). Bien que l’implication de LPHN2 dans les TEM ait été démontrée pour des TEM de type 1 (TEM ayant lieu durant le développement embryonnaire), les mécanismes sous-jacents aux TEM de type 1 et de type 3, sont susceptibles de faire appel aux mêmes voies de signalisation. Ainsi, la surexpression de LPHN2 dans les cellules souches cancéreuses pourrait être une caractéristique des cellules souches cancéreuses. La confirmation de la surexpression de LPHN2 dans d’autres cellules souches cancéreuses issues de glioblastomes et d’autres cancers pourrait renforcer l’hypothèse de l’importance de LPHN2 pour les cellules souches cancéreuses. LPHN2 pourrait être un biomarqueur des cellules souches cancéreuses.

Les deux autres RCPG mis en évidence dans notre analyse sont GPR37 et HRH2. Ils sont exprimés à un niveau environ 10 fois inférieur à celui de LPHN2 dans les cellules TG1 et OB1. Le récepteur GPR37 est exprimé dans les oligodendrocytes et au niveau des neurones de l’hippocampe et des neurones dopaminergiques. Il est impliqué dans la maladie de Parkinson, où il est retrouvé dans les agrégats protéiques insolubles. Lorsqu’il est surexprimé dans les cellules, il semble être impliqué dans un processus autophagique

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(Marazziti et al., 2009). La voie de signalisation de ce récepteur n’a jusqu’à présent jamais été impliquée dans un processus de cancérogenèse.

HRH2 est connu pour être impliqué dans les cancers notamment dans la prolifération des cellules cancéreuses (Wang et al., 2000) et dans l’activation du processus angiogénique (Ghosh et al., 2001). Ces propriétés d’action de HRH2 dans les cancers pourraient faire de ce récepteur une bonne cible thérapeutique. Cependant, plusieurs agonistes (amthamine, dimaprit, et 4-méthylhistamine) et antagonistes (cimétidine, zolantidine, ranitidine, burimamide, thiotidine et famotidine) spécifiques du récepteur histaminique H2 ont été testés sur la viabilité des cellules TG1 à 10µM et à 50µM. Aucun de ces composés ne semble capable de réduire ou d’augmenter la viabilité des cellules TG1 de manière significative (figure 41). Ces données semblent indiquer que le récepteur HRH2 n’est pas un bon candidat en tant que cible thérapeutique. Une absence d’effet antitumoral des antagonistes des récepteurs histaminiques H2 avait été observée sur des tumeurs murines (Bossa et al., 1983). Des investigations supplémentaires concernant l’expression de HRH2 dans d’autres types de CSC de glioblastomes et d’autres lignées cellulaires, mais aussi des études de signalisation impliquant ce récepteur sont indispensables à la compréhension du rôle de ce récepteur dans la pathologie cancéreuse.

Figure 41 : Criblage de molécules agonistes et antagonistes du récepteur histaminique H2 sur les cellules TG1 proliférantes.

Cet histogramme représente l’effet des molécules agonistes (amthamine, dimaprit,

4-méthylhistamine) et antagonistes (cimétidine, zolantidine, ranitidine, thiotidine, burimamide

et famotidine) spécifiques du récepteur HRH2 sur la viabilité des cellules souches

cancéreuses issues de glioblastomes TG1 qui surexpriment ce récepteur. Chaque composé a

été testé en triplicata à 10µM (en rouge) et à 50µM (en bleu). L’expérience a été réalisée une

foisen triplicata, à l’aide du test Cell Titer Glo® (Promega). Les résultats sont normalisés en

pourcentage par rapport au contrôle négatif (1% DMSO). La terfénadine à 50µM est utilisée

comme contrôle positif.

0 20 40 60 80 100 120 140 V ia b il it é c e ll u la ir e (% ) 50µM 10µM

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Ces trois gènes surexprimés dans les cellules OB1 et TG1 sont des gènes qui sont situés sur des chromosomes présents en plusieurs copies dans les cellules TG1 (tableau 7). Cependant, d’autres gènes surexprimés dans ces cellules souches cancéreuses et notamment dans TG1 ne sont pas situés sur des chromosomes présents en plusieurs copies dans les cellules (exemple : EDG8 sur le chromosome 19 et GPR138 sur le chromosome 3). Des mécanismes de régulation de la transcription tels que la méthylation des promoteurs des gènes, pourraient empêcher certains gènes présents sur les chromosomes amplifiés, d’être exprimés. Inversement, des gènes présents sur des chromosomes non amplifiés pourraient être surexprimés.

Gène Chromosome Nombre de copie dans les cellules TG1

CALCRL 2q32.1 3 EDG8 19p13.2 2 GPR37 7q31 6 GPR73 2p14 3 GPR103 4q27 3 GPR128 3q12.2 2 HRH2 5q35.2 3

↗ avec les passages (nos données SNP)

LPHN2 1p31.1 3

Tableau 7 : Position des gènes RCPG surexprimés dans les cellules souches cancéreuses TG1 et OB1 sur les chromosomes.

Les gènes des récepteurs couplés aux protéines G surexprimés dans les cellules TG1 et OB1.