Le génotypage par Multiple-Loci VNTR Analysis

La MLVA est une méthode de typage qui exploite le polymorphisme de taille des VNTR, c’est-à-dire la variation du nombre de répétitions de ces marqueurs entre les isolats d’une même espèce. Le principe de cette technique repose sur l’amplification par PCR de plusieurs VNTR situés à différentes localisations sur le génome. Il est possible d’amplifier un VNTR par l’utilisation d’amorces positionnées au niveau des régions flanquantes. Dès lors, la taille totale de l’amplicon peut être déterminée par électrophorèse capillaire ou sur gel d’agarose. Ainsi, connaissant et la taille du motif répété et la taille des régions flanquantes en amont et en aval du VNTR, il est possible de déduire le nombre de motifs répétés selon la formule suivante :

Nombre de TR = Taille de l’amplicon (pb) – Taille des régions flanquantes 5’ et 3’ (pb) Taille des motifs répétés (pb)

Une fois le nombre de TR déterminé pour chaque VNTR, il est possible de définir des profils multilocus, dont les numéros correspondent au nombre de TR de chaque locus.

Chaque code numérique correspond à un profil unique appelé MLVA-type (MT). Des MT peuvent être regroupés en MLVA-Complexes (MC), s’ils ont le même nombre de TR pour six des sept loci étudiés.

La mise au point d’un schéma de MLVA commence par l’identification in silico de VNTR. Elle nécessite l’utilisation du logiciel Tandem Repeat Finder (TRF) qui permet d’identifier des séquences répétées en tandem au sein de génomes complets²¹⁴. Il est alors nécessaire d’évaluer in silico le polymorphisme des VNTR par comparaison de plusieurs génomes de la même espèce bactérienne. Les marqueurs présentant des variations suffisamment importantes sont alors testés in vitro sur un panel de souches bien caractérisées et représentatifs de la diversité de la population de l’espèce étudiée.

Ainsi, un VNTR est validé comme un bon candidat pour le schéma de MLVA (i) s’il est présent chez tous les isolats testés, (ii) s’il présente une taille supérieure à 5 pb pour un motif répété, (iii) s’il ne présente pas d’insertion ou de délétion dans les motifs répétés, (iv) si les régions flanquantes sont conservées entre tous les isolats testés. De plus, les amorces nécessaires à son amplification doivent être situées le plus proche possible du VNTR²¹⁴.

La MLVA est une méthode qui fait preuve d’un important pouvoir résolutif chez plusieurs espèce bactériennes. Chez les bactéries à Gram négatif comme Salmonella par exemple, la MLVA est utilisée comme un outil puissant de surveillance épidémiologique au niveau mondial^215,216. Chez les bactéries à Gram positif, des schémas de MLVA ont été adaptés à plusieurs espèces bactériennes : L. monocytogenes²¹⁷, S. agalactiae²¹⁸, S. aureus²¹⁹, S. epidermidis²²⁰ …

4.3.1.2. MLVA & S. aureus

Le premier schéma de MLVA dédié à l’espèce S. aureus a été développé par Sabat et al.²¹⁹ en 2003. La méthode a été adaptée d’une technique de typage moléculaire rapide basée sur le polymorphisme de taille de fragments amplifiés après digestion enzymatique des gènes codant la protéine A, la coagulase libre et les régions hypervariables en amont du gène mecA^221,222.

Par ailleurs, le séquençage de génomes de S. aureus a permis l’identification de la présence de VNTR intra-géniques. C’est pourquoi, Sabat et al.²¹⁹ ont développé un schéma de MLVA basé sur l’étude de cinq VNTR localisés dans les gènes suivant :

- clfA : clumping factor A - clfB : clumping factor B

- sdrCDE : locus codant les adhésines riches en répétitions SD, SdrC, D et E - sspA : sérine protéase V8

- spa : protéine A de liaison au fibrinogène

L’analyse des VNTR a montré des TR d’une taille allant de neuf à 24 pb par électrophorèse sur gel d’agarose à partir d’une collection de 34 isolats de SARM et a permis l’identification de 26 profils de MLVA. L’analyse des profils générés a montré que le MLVA était capable de distinguer les isolats d’origine géographique différente tout en regroupant les isolats épidémiologiquement liés dans des mêmes génotypes ou des génotypes proches. Cette étude a en outre prouvé que le pouvoir discriminant de la MLVA était comparable à celui de la technique de typage par électrophorèse en champ pulsé²¹⁹. Toutefois la MLVA présente aussi l’avantage d’être une méthode sensible, simple et permettant l’analyse rapide d’un

Figure 55 : Minimum Spanning Tree des 1681 isolats de S. aureus typés par Multiple Locus Variable Number Tandem Repeat (VNTR) Analysis (MLVA)²²⁷. Chaque cercle représente un MLVA Type (MT) et la taille du cercle est proportionnelle au nombre d’isolats de ce MT. Les zones de couleur autour des cercles délimitent les MLVA complexes. Les lignes épaisses relient deux MT qui diffèrent par un seul VNTR alors que les lignes fines relient deux MT qui diffèrent de deux VNTR.

plus grand nombre d’isolats avec la possibilité de produire des données exportables et échangeables depuis l’utilisation de l’électrophorèse capillaire.

Il existe plusieurs schémas de MLVA chez S. aureus utilisant de six à 12 VNTR différents^223–227. L’inconvénient de certains de ces schémas est qu’ils utilisent des VNTR avec des TR d’une taille trop faible pour une détermination précise du nombre de motifs répétés par électrophorèse sur gel d’agarose. Par ailleurs, des amplifications aspécifiques ont été obtenues pour certains loci comme le locus sdr rendant l’assignation de profils difficile pour certaines souches. Ces difficultés rendent alors la méthode peu reproductible et peu fiable en produisant des données de typage ambiguës²²⁷.

C’est pourquoi en 2009, Schouls et al.²²⁷ ont utilisé les VNTR présents dans neuf génomes de S. aureus pour mettre au point un nouveau schéma de MLVA. L’analyse in silico à l’aide du logiciel TRF a mené à l’identification de plus de 20 VNTR, dont la majorité présentaient des TR imparfaits. Ces VNTR ont été testés sur un panel comprenant des souches de S. aureus de référence dont le génome a été séquencé. Dès lors, n’ont été conservés que les VNTR (i) amplifiables par PCR chez toutes les souches, (ii) ne présentant pas d’amplification aspécifique et (iii) présentant au moins trois, mais pas plus de dix allèles différents²²⁷. Au final, huit VNTR ont été conservés dont cinq localisés dans des régions non-codantes (VNTR61_01, VNTR61_02, VNTR67_01, VNTR21_01 et VNTR63_01) et trois localisés dans le gène sspA codant la cystéine protéine SspA, le gène spa codant la protéine A et le gène coa codant la coagulase libre.

Ce schéma a alors été appliqué à une collection de 1681 isolats de S. aureus collectées chez des patients néerlandais. Le nombre de répétitions entre les différents loci allait de cinq (VNTR21_01) à 25 répétitions (sspA), générant un pouvoir discriminant variable selon les VNTR, souligné par des valeurs de DI très hétérogènes variant de 0,342 (VNTR21_01) à 0,830 (spa)²²⁷. Ainsi, les 1681 isolats ont été individualisés en 511 MT répartis en 11 MC (Figure 55). Ces résultats ont été comparés à ceux des méthodes de typage de PFGE et de spa-typing (cf paragraphe 4.3.2). Il a été montré que la MLVA était aussi discriminante que la méthode de PFGE avec des DI similaires de 0,985 et de 0,977 respectivement. Le DI de la méthode de spa-typing était légèrement inférieur aux deux autres méthodes puisque égal à 0,962.

Figure 56 : Minimum Spanning Tree (MST) basé sur les données de typage de Multiple Locus Variable Number Tandem Repeat (VNTR) Analysis pour 40

isolats de S. aureus²²⁷.

Le MST illustre la concordance des génotypes obtenus par MLVA et MultiLocus Sequence Typing (MLST). Chaque cercle représente un MLVA Type (MT) et la taille du cercle est proportionnelle au nombre d’isolats de ce MT. Le nombre inscrit dans chaque cercle représente le Sequence Type (ST) et les couleurs représentent les complexes clonaux (CC) obtenus par MLST. Les cercles blancs représentent des ST qui ne font pas partis d’un CC.

Seuls les MT qui ne varient que par un ou deux loci, sont reliés par un trait.

Bien que discriminante, la MLVA était congruente avec les autres méthodes de typage. Le niveau de congruence peut être défini par le coefficient de corrélation de Pearson. Ce coefficient définit la probabilité que deux isolats de même génotype, défini par une première méthode, soient aussi de même génotype avec une seconde méthode de typage. Dans cette étude, les résultats de la méthode de MLVA étaient congruents avec ceux de PFGE à 77%, c’est-à-dire que deux isolats avaient une probabilité de 77% d’être de même génotype avec les deux méthodes. Les auteurs ont alors évalué la congruence des résultats de typage de MLVA et de MLST. Pour ce faire, les résultats de typage de 40 isolats ont été comparés. A partir d’un arbre phylogénétique de type Minimum Spanning Tree (MST) basé sur les données de MLVA, la répartition des isolats a montré un haut degré de congruence avec les CC. En effet, les ST appartenant à un même CC étaient aussi regroupés par MLVA (Figure 56). Par ailleurs, le coefficient de corrélation de Pearson a montré une congruence de 86,5% entre les résultats de MLST et de MLVA. Ainsi, bien qu’elle soit congruente avec la MLST, la MLVA reste plus discriminante et permet de subdiviser les CC²²⁷.

Schouls et al.²²⁷ ont aussi évalué la concordance épidémiologique de la méthode de MLVA sur une collection de 658 d’isolats de SARM provenant de différents hôpitaux sur une période de 10 mois. Le typage par MLVA s’est montré capable de regrouper des isolats d’un même hôpital en un même MT ou en plusieurs MT proches. Ainsi, cette méthode de typage est fiable pour identifier des isolats épidémiologiquement liés et constitue un outil de micro-épidémiologie pour étudier la dissémination des souches de SARM dans des contextes d’épidémies.

Aujourd’hui, c’est le schéma de Schouls et al.²²⁷ qui prévaut grâce à une standardisation de la méthode permettant une reproductibilité des résultats entre laboratoires. En effet, jusqu’en 2009 la méthode de MLVA utilisait l’électrophorèse sur gel d’agarose pour déterminer la taille totale du fragment amplifié et déduire le nombre de TR.

Ainsi, cette équipe a mis au point un schéma utilisant deux PCR multiplex permettant chacune l’amplification de quatre VNTR à l’aide de quatre sondes fluorescentes différentes.

Ces marqueurs fluorescents sont utilisés pour déterminer la taille précise de chaque VNTR par électrophorèse capillaire. Les protocoles et la procédure détaillée de la méthode sont disponibles sur le site (https://www.mlva.net/saureus) où il est également possible de déterminer les MT des isolats testés en fonction des profils obtenus.

4.3.1.3. MLVA & SCN

Comme pour la méthode de MLST, des schémas de MLVA existent pour plusieurs espèces de SCN comme S. epidermidis²²⁰, S. haemolyticus²⁰⁵ et S. hominis²²⁸.

Pour S. epidermidis, la technique de MLVA a été développée par Johansson et al.²²⁰ pour étudier une population de 30 souches multi-résistantes aux antibiotiques isolées à l’hôpital universitaire d’Umeå en Suède.

L’analyse du génome de la souche ATCC12228 avec le logiciel TRF a permis d’identifier 137 VNTR. Au final, seulement cinq ont été conservés, présentant au moins deux motifs répétés et une taille minimum du motif répété de 18 pb. Un seul VNTR était inter-génique, les quatre autres étaient localisés dans des gènes dont trois codant des protéines de liaison au fibrinogène de la famille des adhésines riches en répétition SD²²⁰.

Afin de juger du pouvoir discriminant des cinq VNTR, un typage par électrophorèse en champ pulsé a également été réalisé. La congruence entre les deux méthodes était remarquable puisque 16 génotypes ont été identifiés pour chacune d’elles avec une répartition identique des isolats.

L’analyse de la dissémination de génotypes multi-résistants de S. epidermidis à l’hôpital d’Umeå a montré que de nombreux isolats liés épidémiologiquement étaient répandus dans plusieurs services hospitaliers. En effet, lors de cette étude, il a été observé une association entre le MT prédominant et des isolats responsables d’infections profondes de cicatrices post-opératoires après implantation d’un dispositif médical. Par ailleurs, le génotype majoritaire a été identifié à partir d’isolats prélevés dans plusieurs services de chirurgie thoracique, de chirurgie-ophtalmologie et de chirurgie orthopédique⁷⁵. Ces résultats suggèrent qu'un clone de S. epidermidis a persisté à l’hôpital et que ce clone a diffusé au sein des services pour coloniser les patients.

En conclusion, la MLVA est une méthode de génotypage qui produit des données non-ambiguës et échangeables pouvant être comparées entre les laboratoires, contrairement à la méthode de typage par électrophorèse en champ pulsé. Par ailleurs, elle a l’avantage, par rapport à la MLST, d’être rapide d’utilisation et moins coûteuse, ne nécessitant pas l’utilisation du séquençage. En outre, à nombre de loci comparable, la MLVA permet d’augmenter de façon significative le nombre de génotypes obtenus par son haut pouvoir

Figure 57 : Représentation des domaines composant le gène codant la protéine A de S. aureus²³⁴.

Les rectangles représentent les portions du gène spa qui codent le peptide signal (S), le domaine de liaison à l’immunoglobuline G (A-D), une région homologue à la région codant le domaine de liaison à l’immunoglobuline G (E), la région C-terminale (X) qui comprend la région composée de motifs répétés de 24 pb (Xr) et le motif d’ancrage à la paroi (Xc). Les flèches 1095F et 1517R représentent les sites d’appariement des amorces forward et reverse utilisées pour le spa-typing.

résolutif. Par ailleurs, l’utilisation de l’électrophorèse capillaire fait de cette technique une méthode très fiable et reproductible, surtout pour des études micro-épidémiologiques.

Il existe une autre méthode de typage bactérien basée sur le polymorphisme des VNTR et notamment celui des TR dégénérés. Cette technique appelée Tandem Repeat Sequence Typing (TRST) consiste, en plus de la détermination du nombre de motifs répétés, à déterminer la séquence nucléotidique par séquençage Sanger de chacun des motifs répétés du VNTR. Cette méthode a été appliquée chez différentes espèces bactériennes telles que Salmonella sp²¹⁵, Streptococcus pneumoniae²²⁹, C. difficile²³⁰, Legionella pneumophila²³¹ et Francisella noatunensis²³², par séquençage d’un ou plusieurs loci et a révélé un haut pouvoir discriminant.