L’analyse par Multi-Virulence Locus Sequence Typing (MVLST)

L’objectif du typage par MVLST est de mettre en évidence des lignées hypervirulentes associées à un contexte clinique sévère. Son principe repose sur celui de la MLST, excepté que son analyse est basée sur le polymorphisme de six à huit loci codant des facteurs de virulence reconnus ou des protéines potentiellement associées à la virulence. Le pouvoir résolutif de cette méthode repose sur le fait que ces gènes, plus soumis à la pression de l’environnement que les gènes domestiques, évoluent plus rapidement. Ici, les profils alléliques sont appelés des Virulence Types (VT) et peuvent être regroupés en Complexes Clonaux associés à la virulence (CCV) s’ils partagent au moins cinq loci identiques⁹⁸.

Cette méthode de génotypage a été mise au point pour plusieurs espèces bactériennes à Gram positif, comme Clostridium difficile²¹⁰ ou Listeria monocytogenes²¹¹. Chez S. aureus, un schéma de MVLST a été développé par Verghese et al.²¹² en 2012 sur une collection de SARM préalablement caractérisés par typage de la cassette SCCmec.

Les gènes associés à la virulence choisis pour ce schéma sont décrits ci-dessous : - atl : autolysine bifonctionnelle

- essC : protéine transmembranaire du SST7 - geh : lipase

- hlgA : γ-hémolysine - htrA : sérine protéase

- sdrC : adhésine riche en sérine – aspartate (SD)

L’analyse par MVLST s’est montrée plus discriminante que la MLST puisqu’à partir des 107 isolats, 13 ST et 38 VT ont été identifiés. Elle a aussi permis de subdiviser les SARM au sein des CC définis par MLST et de distinguer les isolats responsables d’infections communautaires de ceux responsables d’IAS²¹².

Chez S. lugdunensis, le schéma de MVLST a été développé par Didi et al.⁹⁸ en 2014 sur la collection de 87 isolats cliniques utilisée pour la mise au point de la MLST²⁰⁸. A ces derniers, ont été ajoutées six souches isolées en simple condition de portage. Le typage par MVLST a consisté en l’analyse des sept gènes codant des facteurs de virulence ou des protéines potentiellement associées à la virulence suivants (Figure 51) :

- atlLR2 et atlLR3 : domaines putatifs d’ancrage de l’autolysine AtlL à la paroi

Figure 52 : Dendogramme construit par la méthode neighbor-joining représentant les relations phylogénétiques entre les 94 isolats de S. lugdunensis caractérisés par Multi-Virulence Locus Sequence Typing⁹⁸. Les complexes clonaux associés à la virulence (CCV) sont représentés par des accolades.

L’origine clinique est représentée par une abréviation : OA, infection ostéoarticulaire ; SST, infection de la peau et des tissus mous ; M, infection sur matériel ; B, bactériémie ; Ca, portage.

L’origine géographique des souches est indiquée par une lettre majuscule : A, Rouen ; B, Nantes ; C, Nancy ; D, Bordeaux ; E, Montpellier ; F, Versailles ; G, Louvain (Belgique) ; H, Maribor (Slovénie) ; I, Tours ; J, Kronoberg (Suède) ; K, Lyon.

- hlb : hémolysine putative

- isdJ : protéine putative impliquée dans la captation du fer - SLUG_09050 : hémolysine III putative

- SLUG_16930 : protéine putative de liaison au fibrinogène et à la fibronectine - vwbl : protéine de liaison au vWF

Pour les 93 isolats d’origines clinique et géographique différentes, 43 VT répartis en six CCvs ont été décrits. Le schéma de MVLST est donc plus discriminant que celui de MLST, qui avait mené à l’identification de 20 ST (Figure 52). Les quatre VT majeurs étaient partagés par cinq à 14 isolats, et 32 des 43 VT étaient représentés par un seul isolat, soulignant la diversité génétique de la population étudiée. De plus, tout comme pour la MLST, le calcul de l’index d’association (IA = 3,740) confirmait le caractère clonal de la population de S. lugdunensis. Cet index suggère une faible fréquence voire une absence de recombinaison des gènes associés à la virulence. Au total, la méthode de MVLST confirme la structure clonale de la population de S. lugdunensis et suggère une co-évolution des gènes de virulence avec les gènes domestiques⁹⁸.

Un schéma trilocus, simplifié, se basant uniquement sur l’analyse de trois loci, (atlLR3, isdJ et SLUG_16930) s’est révélé aussi discriminant que le schéma de MVLST à 7 gènes avec un DI de 0,922 pour le schéma trilocus contre 0,943 pour le schéma complet⁹⁸.

Tout comme avec le schéma de MLST, aucune corrélation entre l’origine clinique et géographique des isolats et les VT n’a été observée. Enfin, aucune lignée hypervirulente, ni aucun génotype spécifique des souches de portage n’a été identifié. Toutefois, l’analyse de MVLST portait seulement sur l’étude de six souches de portage⁹⁸.

Ainsi, il existe à ce jour deux méthodes de typage et de suivi macro-épidémiologique des souches de S. lugdunensis, la MLST et la MVLST, basées sur l’analyse de sept loci pour chacune d’elles, avec la possibilité pour la MVLST d’utiliser un schéma trilocus résolutif. Néanmoins, aucun schéma de typage n’a permis d’associer un génotype à un tableau clinique, et ce d’autant plus que les souches invasives et celles isolées en simple condition de portage (mais seulement au nombre de six) étaient associées au sein des mêmes complexes clonaux.

Figure 53 : Organisation générale d’un Variable Number Tandem Repeat (VNTR)²¹⁴.

Les rectangles bleus représentent les motifs répétés qui composent le VNTR. Au niveau des régions 5’ et 3’ sont représentés les régions flanquantes conservées. Les flèches au niveau de ces régions représentent les sites d’appariement des amorces pour l’amplification par PCR.

A

B

Figure 54 : Représentation des différents types de répétitions en tandem (TR) (A) et des différents types de Variable Number Tandem Repeat (VNTR) (B)²¹³. A, Le premier VNTR présente des TR conservés (parfaits) alors que le second présente des TR dégénérés (imparfaits) avec des variations.

B, Taille des TR en fonction des différents types de VNTR.

4.3. Le génotypage basé sur l’étude des Variable Number Tandem Repeats